Способ определения витаминов группы Е Советский патент 1982 года по МПК G01N31/08 

(54)

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ ГРУППЫ Е

Изобретение относится к химическим Улетодам определения витаминов группы Е (токоферолов) с применением хроматогра- фнческих методов очистки, в частности тонкослойной хроматографии (ТХС) и может быть использовано при определении содержания токоферолов в кормах, пише- вых продуктах, в органах и тканях животных (например, для контроля их Е «итаминного кормления) в медицинских, ветв ринарных и других биологических исследованиях, а также для контроля производства витамина Е, Известен способ определения витаминов группы Е в биологическом материале, включающий экстракшпо общих лшшдов из ткани органическими растворителями, выделение и очистку токоферола методом тонкослойной хроматографии, окисление его цотокоферилхинона и спектрофотометрическое определение послеанего f l Недостатком способа является его oi носителъно невысокая чувс-гаитеяьвос.ть. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является спсюоб опреДелеиия витамина Е в биологическом объекте, заключающийся в том, что иавеску материала омыляют спиртовым раствором щелочи, экстрагируют неомыляемые липиды {эфиром и отмывают дистиллированной водой донейтральной реакции, высушивают эфирный экстракт сульфатом натрия, упаривают его, растворяют в малом объеме растворителя н наносят на специально приготовленные хроматографические пластинки с незакрепленным слоем, обнаруживают токоферолы при ультрафиолетовом облучении по свидетелю, снимают с пластинки слой адсорбента и элюируют витамин Е растворите- , лем, упаривают раствор витамина, растворяют остаток в спирте, производят реакцию и фотометрируют полученный раствор. Коишнтрацию витамина Е определяют DO предварительно построеннойко либровочвой кривой f 2 . Недостатками известного способа яв- nsnoTCfl длительность анализа, низкая точность и чувствительность. Цель изобретения - сок1)ащение длительности анализа, а также повьпиение точности и чувствительности способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения витаминов группы Е путем омыления анализируе мой пробы в присутствии пирогаллола в атмосфере азота при 9О , экстракции эфиром неомыляемой части пробы, высушивания эфирного экстракта, выпаривания и растворения полученного остатка в хло{1оформе, с последующим тонкослойным хр1оматографическим разделением полученного раствора путем нанесения его на хроматографическую пластинку, после чего пластинку с хлороформным ре створом обрабатывают иветореагентом - смесью ct о/ -дипиридила и хлорного железа с последующим элюированием окрашенного адсорбированного слоя смесью, содержащей этанол, соляную кислоту, фосфорную, кислоту и бидистиллированную воду, при следующем соотношении компонентов, об.% Этанол45-55 Соляная кислота2О - ЗО Фосфорная кислота6 - 1О Бидистилированиая вода5 - 29 и фотом етрированием элюента. Предлагаемый способ позволяет селективно определять изомеры витаминов группы Е (токоферолов), причем локали зашпо токоферолов о -изомера определяют по свидетелю, а ft + (j изомеров - по величине R. Пример. Определение витамина Е в печени индюков. Навеску гомогената печени (3-5г) переносят в колбочку для омыления, добавляю 5О мл этанола, 10О мг пирогалл ла, 5 мл 60%-ного раствора гидроксида калия, присоединяют обратный холодильник, продувают азот 5-7 мин н омыляют на глицериновой бане 2О мин при 90 . Затем охлаждают в трижды экстра гируют неомыЛвемую фракцию эфиром пор тями по 40 мл. Затем эфирный экстракт отмывают до нейтральной реакции дйс ТЕПЛ рованной водой по бром тимоловому синем высушивают безводцым сульфатом натрия и выпаривают в токе азота на роторном . испарителе. Далее сухой остаток растворяют в О,1 - р,2 мл хлороформа я микро шприцом/наносят 0,О5-О,1 мл раствора на стартсй&ую лннию фоматогра(я1ческой плacтиtlкя в вире полосы длиною 2030 мм. Рядом наносят свидетель-примерно 3-5 мкг of. токоферола. Хроматографическое разделение токоферолов на подготовленных пластинках осуществляют в камере, насыщенной . парами хлороформа, через которую в течение 15 мин продувают азот. Когда 4рон.т растворителя приближается к верхнему краю пластинки, необходимо Извлечь ее из камеры и высушить в токе азота при 35 - . Затем обильно опрыскивают пластинку свежеприготовленным проявляющим раствором, состоящим из равных объемов 0,5%-ного раствора oL , OL -дипирндила и 0,2%-ного раствора хлорного железа и этаноле. Обработанную пластинку выдерживают в горизонтальном положении 5 - 7 мин, чтобы проявлякнций раствор впитался адсорбентом и количественно прореагировал с витамином Е с образованием розовокрасного пятна. Затем подсушивают пластинку в инертной атмосфере при 20-25 0 определяют локализацию «/-токоферола по свидетелю и количественно переносят окрашенный участок адсорбента в пробирку с притертой пробкой. Затем в пробирку приливают 3 мл элюирующей смеси, состо шгей из этанола, соляной и фосфорной кислот и бидистиллата в объемных соотношениях 6:3:1:2, энергично встряхивают 15 - 20 с и филы руют через обеззоленный фильтр (красная лента). Ополоснув пробирку 1 мл этой же смеси, переносят ее на тот же фильтр. Полученный розовый фильтрат фотометрируют при Л« 53О нм, по сравнению с алюируюшей смесью. Оодержание; витамина Е вычисляют по формуле V содержание об-токоферола в ткани, мкг/г; объем хлороформа, в котором растворена проба, мл; , объем хлороформенного раствора, нанесенного на пластинку, мл; навеска субстрата, г; 9 количество -токоферола по калибровочному графику. Пример 2. Определение изомеров токоферола в травяной муке. .Навеску травяной муки (1-2 г) переносят в колбочку с притертой робков, за ливают 10О мл афера и: встряхивают на шюттелъ-вппарате 20 М11н §атем фвлы руют в упаривают эфир в атмосфере азота на роторном испарителе. Сухой остаток 5974 растворяют в 0,05 - 0,1 мл хлорсформа в микрошприцом наносят 0,025 - О,05 мп этого раствора на стартовую линию хроматографической пластинки (пластинку не нагревать) в виде полосы, длиною 40 80 мм. Рядом наносят свидетель, соде{ жаший примерно 3-5 мкг cL -токоферола. Процедуры хроматографирования, опрыскивания и подсушивания пластинки такие же, как н при определении витамина Е в пе- чени, определяют локализацию токоферолов об-изомера по свидетелю, а f + по величине R. {. Все дальнейшие процедуры такие же, как и определение витамииЖ в примере 1. При отсутствии специальных сввдетелей допустимо определение коиЛентрации изомеров по калибровочному графику построенному по Ы, -токоферолу. На пластинках Силуфол разделяется 3 - 40 мкг витамина Е. Если интенсивность окраски пятна мала, цветной комп- 30,94i.0,158 6

24,6+0,82 Шределение / -токо88,4 94,8 98,9 1ОО ферола, %

9656,7 2-60

82,9 159 14-40

Таблица 2 2 леке элюируют из нескольких пластинок. При элюировании пятен спирто-водным риствором кислот расхождения между параллелями не превьпиают 1% и окраска элюита устойчива 15-20 мин. Сравнительные данные определения вС-токоферола в желтке индюшиных яиц приведены в табл. 1. В табл. 2 приведено определение до пустимых пределов состава вещества. Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время анализа. Вслед ствие его большей точности, чувствител1гности и селективности по сравнению с известным способом удобно его исполь- . зование для определения изомеров токоферолов в травяной муке, витаминная ценность которой определяется не изомеров, а содержанием только оС-ток(хферола, что позволяет, более рационально использовать Енаитаминные корма. (Таблица 1 98,7 93,6 90,1

Формула иэрбретения

Способ определеявя витаминов rptynпы Е путем омыпения анализируемой пробы, экстракции эфиром неомыпяемой час ти пробы, высушивания эфирного экстракта, выпаривание и растворение полученно го остатка в хлороформе с послеяуюпо м тонкослойным хроматографическим разделением подученного раствора путем нанеи сешш его на хроматографическую пластяосу с использованием элюирования ад, сорбированногоСЛОЙ, обработки 1фетореагентом и ютометрирования элюента, отличающийся тем, что, с I целью сокращения длительности анализа, , повышения точности и чувствительности способа, омыление ведут в присутствии пирогаллола в атмосфере азота при 90 95 С и пластинку с хлороформным раст вором обрабатывает оветореагентом - смесью oL,-ci-дипиридипа и хлорного якпеаа с последукшим элюированием окрашенного адсорбированного слоя сме974262

8

СЬЮ. содержащей этанол, .ту, фосфорную кислоту и ную воду, при следующем компонентов, об. %:

Этанол

Соляная кислота

Фосфорная кислота

Биднстнллированная вода

и фотометрированием алюента.

Источники Ш1фо{ мации, принятые во внимание при экспертизе

1,Нейфах Е. А., Буробина С. А.

IS Количественный метод определения токоферола и его производных в tKaHsoc живо-гных. - Вопросы медицинской химии. 1967. т.ХШ., № 1. с. 94 - 97.

2.Крюков.В. С., Дмитровский А. А. 30 и др. Определение витаминов А. Е и каротиноидов в кормах,, препаратах и биологическихобъектах. Методические рекомендации ВНИТПП, Загорск. 1978, с. 3-i 23.