Способ получения иммобилизованных оксидоредуктаз Советский патент 1984 года по МПК C12N1/14 

Изобретение относится к .способам иммобилизации ферментов класса окси доредуктаз на неорганических носителях и получению на их основе эффективных гетерогенных биокаталиэаторрв для практического применения. Известен способ двойной иммобилизации ферментов в полцакрилами ном геле, армированном неорганическим скелетом: кремнезернистым или металлическим материалом с диаметром пор свьше 700 А 1J . Недостатком способа является возможность значительной дезактивации ферментов в процессе свободно радикальной полимеризации геля, кроме того получаемый способом конечный продукт имеет низкие физико-мехапические характеристики: мал механическую прочность, большое гидродинамическое сопротивление. Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения иммобилизованных оксидоредуктаз путем добавления буферного раствора ферментов к пористому неорганическому носителю - окиси алюминия ( . 100 ,.радиус пор 175 А, 2 0,6 ), причем в качестве фермента используют глюкозооксидаЗУ 2. , Недостатками способа являются длител;ьность процесса получения иммобилизованного фермента (адсорбция протекает в течение 17-18 ч) и .низкая стабильность положенного препарата (адсорбированный фермент дезактивируется за 7 сут). Целью изобретения является увели чение стабильности целевого продукта и ускорение процесса иммобилизации. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованных оксидоредуктаз пут добавления буферного раствора ферме тов к пористому неорганическому Носителю окиси алюминия, буферный р створ ферментов предварительно смешивают с золем кремниевой кислоты, имеющим рН 7-8 и застывающим в пора носителя за 1-2 мин, а затем пропи тывают полученной смесью сухую окись алюминия или сзгхой силикагель Сущность способа заключается в том, что свежеприготовленным золем кремниевой ки(;лоты с растворенным в нем ферментом (рН 7-8) пропитывают сухой носитель, в порах которого за 1-2 мин происходит желатинизация золя, и образуется гидрогель с включенным в него ферментом. Таким образом, фермент оказывается заключенным одновременно и в гель, и в пористую структуру неорганического носителя г- Вся процедура иммобилизации занимает 5-10 мин и отличается простотой и .технологичностью. Полученные предлагаемым способом препараты сочетают в себе преимущества иммобилизации в геле (высокая стабильность и активность) с преимуществами иммобилизации на. неорганических носителях (устойчивость в водных средах, высокая механическая прочность, хорошие гидродинамические показатели и являются перспективными для практического применения в высокопроизводительных реакторах колоночного типа. Кроме того, предложенный способ в силу мягкости условий иммобилизации: комнатная температура, нейтральные значения рН, отсутствие инициирующих радикальные реакции добавок, является более предпочтительным для иммобилизации таких лабильных, сложных по строению, как правило, субъединичных ферментов, как оксидоредуктазы. Конкретно способ осуществляется следующим образом. Навеску сухого носителя пропитывают по влагоемкости свежеприготовленным золем кремниевой кислоты с растворенным в нем ферментом. Золь кремниевой кислоты образуется при смешении в тщательно подобранных пропорциях растворов метасиликата натрия (228 г/л), соляной кислоты (6%) и буферного раствора фермента с таким расчетом, чтобы значение рН этой гелеобразующёй смеси было нейтральным (во избежании дезактивации фермента под действием рН), и ее отверждение происходило после пропитки в порах неорганического носителя, т.е. через 2-3 мин после приготовления. Соотношение объемов жидкого стекла, соляной кислоты и раствора фермента - 1:5:1. После застывания смеси в порах измеряют

ферментативную активность и стабильность полученного препарата иммобилизованного фермента.

Активность иммобилизованных ферментов намеряется в циркуляционной s установке с дифференциальным безградиентным реактором, термостатируемым при 25 С. Стабильность определяется при хранении в буфере и комнатной температуре. Потерял/98% 10 активности считается полной дезактивацией фермента.

П р и м е р 1. Иммобилизация глюкозооксидазы в порах окиси алюминия. . ,15

Навеску (25 мг) сухой 0 -окиси

алюминия (5цд 84 , 120 А, SOO A,V 0,4 ) пропитывают 20 мкл свежеприготовленного золя кремниевой кислоты с растворен- -Q ной в нем глюкозооксидазой (ГО), который застывает чере 1 мин в порах носителя, рН смеси - 7,0.

Ферментативную активность полученного препарата измеряют поляро- 25 графически по убьши кислорода в реакционном растворе. Стабильность определяют при хранении в буфере (рН 6,0) и комнатной температуре (20-22°С). ... ,„ Иммобилизованная предлагаемым спо-

собом ГО |2,9 ---4 сохраняет

; М п Гс ftfl I

32% активности нативного фермента.

При иммобилизации стабильность глюкозооксидазы увеличивается: иммо- 35 билизованный фермент сохраняет 100% первоначальной активности по истечение 1,5 месяцев хранения, тогда как нативная ГО полностью дезактивируется за 30 сут. 40

П р и м е р 2. иммобилизация глюкозооксидазы в порах окиси алюминия.

Иммобилизацию ГО проводят способоьг описанным в примере 1 только подбирают условия таким образом, чтобы золь застьюал в порах носителя через 2 мин после пропитки (рН смеси - 8,0). Свойства полученного препарата иммобилизованной глюкозооксидазы аналогичны примеру 1.JQ

П р и м е р 3. Иммобилизация дрожжевой алкогольдегидрогеназы в порах окиси алюминия.

Иммобилизацию аЛког.ольдегидрогеназы (АДГ) в порах S -окиси алюми -. .-j ния проводят по методике примера f.

Активность АДГ измеряют спектрефотометрически по скорости пойв-.

ления в ферментативной реакции окисления этанола в ацетальдегиД кофермента NAO-H, который поглощают при 340 им. Стабильность определяют в буфере (рН 8,0) и при комнатной температуре (20-22®С).

При иммобилизации АДГ сохраняетс от 6 до 100% активности нативного фермента в зависимости от ее концентрации в геле кремниевой кислоты.

Стабильность иммобилизованной АД увеличивается в сравнении с нативным ферментом в 1,5-4 раза; алкоголдегидрогеназа в растворе полностью дезактивируется за 10 сут, иммобилизованный фермент - за 2-3 недели.

П р и м е р 4. Иммобилизация дрожжевой алкогольдегидрогеназы в прах силикагеля.

Иммобилизацию АДГ в порах сили;кагеля (5. 110 ,г„др 240 А, V О,б см/г) проводят в условиях, описанных в примере 1.

При иммобилизации алкогольдегидрогеназа сохраняет от 3 до 82% активности нативного фермента в зависимости от ее концентрации в геле кремниевой кислоты.

Эффект стабилизации алькогольдегидрогеиазы, иммобилизованной в порах силикагеля, зависит от рН буферного раствора, используемого дця хранения полученного препарата. При нейтральных значениях рН (6,0, 7,0) стабильность включенной АДГ увеличивается в 1,5-3 раза по сравнению с нативным ферментом: иммобилизованная АДГ полностью теряет активность по истечение 1,5 месяца хранения, тогда как нативная - за 1520 сут. При щелочных значениях рН (8,0) стабилизация АДГ незначительна в силу увеличения растворимости силикагеля при рН 7,0 (100 мг/л). Следовательно, для ферментов, рН-оптимум которых находится в щелочной области (алькогольдегидрогенеза), рекомендуется, использовать в качестве носителя только окись алюминия, для ферментов с кислым значением оптимального рН (глюкозооксидаза) - силккагель и окись алюминия.

Наиболее существенным является то, что рН гелеобразующей смеси должно быть близким к нейтральному значению (7-8) ВО избежание инактиваIции фермента под действием щелочных

(раствор жидкого стекла, рНл-14) или кислых (соляная кислота, pHrvl) значений рН, При дальнейшей работе с препаратом иммобилизованного фермента (хранение определения активности) рН в геле определяется значением рН рабочего буфера.

Время застудневания золя подбирается таким образом, чтобы золь кремниевой кислоты успел пропитать пористый носитель и его желатинизация проходила именно в порах.

Главным достоинством предлагаемого способа является ускорение всего процесса получения иммобилизованного фермента: процедура иммобилизации занимает 5-10 мин и складывается из взвешивания носителя (2-7 минХ

смешения реагентов (0,5-1 мин), пропитки (0,1-0,2 мин) и застудневания (1-2 мин).

Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет значительно увеличить стабильность целевого продукта ферменты сохраняют активность в течении 1-1,5 месяцев (по известному способу дезактивация происходит через 1 неделю) . Время иммобилизации также снижается с 17-18 ч до 5-10 мин.

Способ позволяет получать высокоактивные и стабильные препараты иммобилизованных ферментов с хорошими техническим характеристиками: высокой механической прочностью и малым гидродинамическим сопротивлением.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ОКСИДОРЕДУКТАЗ путем добавления буферного раствора ферментов к пористому неорганическоиу носителю - окиси алюминия, отличающийся тем, что, с целью увеличения стабильности целевого продукта и ускорения способа, буферный раствор ферментов предварительно смешивают с золем кремниевой кислоты, имеющим рН 7-8 и застывающим в порах носителя за 1-2 мин, а затем пропитывают полученной смесью сухую окись алюминия ипи сухой силикагель.