Способ получения диагностикума для проведения реакции бентонитовой флокуляции Советский патент 1982 года по МПК A61K39/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ БЕНТОНИТОВОЙ ФЛОКУЛЯЦИИ

1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления антигенов и антител.

Известен способ получения диагностикума для проведения реакции бетонитовой флокуляции путем адсорбции антигена или антител на частицах бетонита при инкубировании смеси с последующей отмывкой целевого продукта 1.

Однако известный способ не позволяет получить диагностикум, обладающий высокой чувствительностью реакции.

Целью изобретения является повышение чувствительности реакции.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения диагностикума для проведения реакции бентонитовой флокуляции путем адсорбции антигена или антител на частицах бентонита при инкубировании смеси с последующей отмывкой целевого продукта, для адсорбции используют частицы бентонита размером 0,0006 - 0,0009 мм в концентрации 1,7-1,9 мг/мл воды.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве сырья лля получения бентонитового диагностикума используют бентонитовые глины различных месторождений СССР, а именно Устиновского (РСФСР), Огланлы (Таджикская ССР), Аскания (Грузинская ССР). Бентонит подвергают специальной обработке. Для, разрушения карбонатов глину обрабатывают 1 н. соляной кислотой, а затем 0,1 н. Образовавшиеся растворимые соли и кварц удаляют путем отмывания дистиллированной водой. Для

10 этого глину с помощью воды переносят в вегетационные стаканы (20x12 см). На каждый стакан наносят метки; первая на высоте 3 см от дна, вторая на 7 см выше, третья на 7 см выше второй. Дистиллированную воду доливают до третьей метки, взмучивают

15 в ней бентонит и оставляют на 12 ч для отстаивания. Когда твердая часть глины оседает, а над ней остается прозрачная жидкость, то последнюю удаляют сифоном и 2Q вновь наливают дистиллированной воды до верхней метки. Когда суспензия остается во взвешенном состоянии, приступают к отмучиванию частиц величиной 0,0006 - 0,0009 мм. Для этого в стаканы наливают дистиллированную воду до верхней метки.

содержимое перемешивают, через 24 ч погружают сифон на глубину 7 см и с его помощью суспензию переливают в стакан-приемник. Отмучивание продолжают до просветления суспензии. В стаканы-приемники к каждой новой порции суспензии добавляют 3-4 капли концентрированной соляной кислоты для коогуляции и осаждения суспензии. Фракцию отмывают дистиллированной водой, а затем высушивают в водяной бане.

190 мг этого бентонита суспендируют в 100 мл дисталлированной воды, в результате, чего получают высокоактивную суспензию иммунноадсорбента.

За счет удаления при отмывании из бентонита кварца и растворимых солей происходит увеличение процентного содержащия глинистой составляющей (монтмориноллитовой фракции) до 80-90%, что обеспечивает повыщение адсорбционных свойств глины.

Приготавливают антигенный бентонитовый диагностикум на основе полученного иммунноадсорбента. В качестве антигена используют 10 млрд. взвесь суточной агаровой культуры шигеллы Флекснера и шигеллы Зонне, которую прогревают в водяной бане в течение 2-4 ч при 100°С с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 1,5 ч. Бентонитовую суспензию смещивают с антигеном в соотноещнии 1:2 (5 мл суспензии и 10 мл антигена). Сенсибилизацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин, затем смесь центрифугируют при 2200 об/мин в течение 7 мин. Осадок дважды отмывают в 15 мл дистиллированной воды центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды, добавляют 1 мл 0,1%-ного метиленового голубого и оставляют на 5 мин. Для удаления избытка красителя к смеси добавляют 10 мл дистиллированной воды и центрифугируют при 2200 об/мин в течение 7 мин, после чего осадок ресуспендируют в дистиллированной воде в объеме 5 мл. В качестве стабилизирующего агента используют 1% твин - 80, который добавляют в количестве 0,5 мл.

Препарат сохраняет свою активность при хранении в условиях холодильника ( + 8 - - 10°С) в течение 20 мес.

Пример 1. Способ постановки реакции торможения бентонитовой агглютинации (РТБа).

Для индикации микробных антигенов используют искусственно инфицированные щигеллами Флекснера пробы воды, молока, овощей и фруктов, которые перед исследованием прогревают в водяной бане при 100°С 30 мин, затем центрифугируют ив реакции используют надосадочную жидкость.

В РТБа применяют коммерческую агглютинирующую неадсорбированную дизентерийную сыворотку к шигеллам Флекснера

(титр 1:12800). Опытным путем устанавливают ее оптимальное рабочее разведение, равное 1:64.

Реакцию ставят в полистироловых пластинках в объеме 0,3 мл. К 0,1 мл исследуемой жидкости добавляют 0,1 мл рабочего разведения сыворотки, содержимое лунок перемещивают и оставляют в термостате на 1,0-1,5 ч при 37°С. Затем во все лунки добавляют 0,1 мл бентонитового дизентерийного диагностикума. Содержимое хорошо перемещивают и оставляют при комнатной температуре.

Постановке реакции сопутствуют два контроля: контроль рабочего разведения сыворотки и контроль диагностикума.

Учет результатов реакции проводят через 20-30 мин невооруженным глазом. Реакция считается положительной, когда частицы бентонита равномерно выстилают все дно лунки в виде круглого пятна голубого цвета. При отрицательной реакции частицы бентонита располагаются на дне лунки в виде зонтика с выраженным фистончатым краем с полным просветлением надосадочной жидкости.

Данная реакция позволяет обнаружить 6-12 тыс. микробных тел в 1 мл исследуемой жидкости.J

С целью проверки специфичности РТБа, реакцию проводят с другими микробами: сальмонелла энтеритидис, щигелла Зонне, эщерихия коли, иерсиния псевдотуберкулезис, иерсиния энтероколитика. Положитель:Ных результатов с указанными антигенами в РТБа не получено.

Исследования показывают, что чувствительность РТБа при использовании предложенного диагностикума размерами частиц составляет 6-12 тыс. микробных тел в 1 мл, а в случае применения известного 50 млн. микробных тел.

Таким образом, РТБа характеризуется специфичностью и высокой чувствительностью, которая превышает чувствительность реакции торможения непрямой гемагглютинации на 5-6 порядков и сокращает время исследования в 7-10 раз. Результаты реакции хорошо воспроизводятся после неоднократного перемешивания содержимого лунок {встряхивани(е не мешает повторному воспроизведению реакции), это позволяет использовать предлагаемый текст РТБа для экспресс-диагностики в полевых условиях.

Пример 2. Способ постановки реакции бентонитовой агглютинации (РБа).

При постановке реакции используют агглютинирующую неадсорбированную дизентерийную сыворотку к шигеллам Флекснера и Зонне.

Сыворотку инактивируют в водяной бане при 56°С в течение 30-40 мин. В полистиролоБых пластинках готовят серийные двукратного разведения сыворотки в физиологическом растворе (рН 7,2) в объеме 0,1 мл. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл бентонитового диагностикума, смесь тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Реакцию сопровождают постановкой контроля на отсутствие спонтанной агглютинации суспензии. Результаты реакции учитывают невооруженным глазом через 20 мин. Реакция считается положительной, когда частицы бентонита располагаются на дне лунки в виде «зонтика (так же как и при обычной реакции непрямой гемагглютинации), с выраженным фистончатым краем и полным просветлением надосадочной жидкости. При отрицательной реакции частицы бентонита равномерно выстилают все дно лунки в виде пятна голубого цвета. Для проверки специфичности РБа ставят реакцию с неадсорбированными сыворотками к шигеллам Зонне, Титр 1:3200 (в случае использования антигена из шигеллы Флекснера); к шигеллам Флекснера, титр 1:12800 (при использовании антигена из шигеллы Зонне; к сальмонеллам энтеритидис, титр к псевдотуберкулезному микробу, 1:12800. Неспецифические реакции отмечены только с сыворотками к шигеллам Зонне в разведении 1:8 - 1:16 (специфический титр 1:3200). В сравнении с чувствительностью аналогичной реакции, поставленной по известному способу, предлагаемая РБа оказывается эффективнее на 7-8 разведений сыворотки (1:262144 и 1:256). Чувствительность Рба при выявлении антител в 10 раз превышает чувствительность сухих и жидких эритроцитных диагностикумов. Так, положительные результаты РБа с сухой ослиной неадсорбированной сывороткой к шигеллам Флекснера (титр 1:12800, серия 221) наблюдаются в разведения 1:131072 - 1:262144, в то врема как в РНГа только в 1:6400 - 1:12800. Таким образом, РБа с использованием бентонитового диагностикума характеризуется специфичностью и высокой чувствительностью. Для проведения этой реакции не требуются термостатные условия, время исследования сокрашается в 7-10 раз по сравнению с РНГа. Результаты реакции хорошо воспроизводятся повторно, после энергичного встряхивания содержимого лунок. Диагностикум для проведения реакции бентонитовой флокуляции характеризуется специфичностью, высокой чувствительностью, превышающей чувствительность известных диагностикумов на 7-8 порядков, позволяет сократить время исследования в 7-10 раз и может быть использован для экспресс-диагностики дизентерии в работе бактериологических лабораторий санэпидстанций. Формула изобретения Способ получения диагностикума для проведения реакции бентонитовой флокуляции путем адсорбции антигена или антител на частицах бентонита при инкубировании смеси с последуюшей отмывкой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности реакции, для адсорбции используют частицы бентонита размером 0,0006-0,0009 мм в концентрации 1,7-1,8 мг/мл воды. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. R. Wallace et al. «The Bentonile Floculation test in the assay of Neisseria antiBody, 1970, 16, № 8, p. 655-659.