Способ определения дозы сенситина,необходимой для получения эритропитарного диагностикума Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

ю

4 N9 N9

СО Изобретение относится к вакцинносывороточному делу и может быть использовано в технологии получения эритроцитарных диагностикумов ветеринарного и медицинского назначения . Известен способ определения дозы сенситина, необходимой для получения эритроцитарного диагностикума, путем анализа сенсибилизировайных разными дозами сенситина эритроцитов. Определение дозы сенситина осуществляется методом пробных посадок, предусма ривающим изготовление пробных образцов препарата, различающихся дозиров кой сенситина. Пробные образцы готовят сенсибилизацией эритроцитов в дозе 62, 125 и 250 мкг антигена на 1 мл эритр.оцитарной взвеси. Затем пр водят реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА) с соответствующей контрол ной кроличьей сывороткой. Для получе ния производственной серии диагности кума выбирают ту из указанных трех доз сенситина, которая агглютинирует ся контрольной сывороткой в разведении до 1/2 титра С 1Известная методика не позволяет оп ределить оптимальную дозу сенситина из-за того, что взят очень большой интервал изменений его концентрации Если же выбрать менышй интервал изменения концентрации антигена, то JC помощью РИГА не удается обнаружить разницу в соответствующих разведениях контрольной сыворотки, т.е. РИГА применительно к рассматри ваемой задаче является неточной, мало чувствительной. Б то же время, заниженная доза антигена ухудшает чувствительность и специфичность диагностикума, а завышенная может привести к спонтанной агглютинации. Другим недостатком известного способа является труднодоступность контрольных сывороток, так как они должны быть получены от больньтх соответствующей инфекцией, вплоть до инфекции, вызванной определенным штаммом возбудителя. При этом очевидно, что контрольные сыворотки мо гут отличаться нестабильностью титров, поскольку они получены от разных больньк. Таким образом, основная причина несовершенства известного способа заключается в трудности установления точной оптимальной дозы сенситина . Цель изобретения - повышение юч-. ности способа. Указанная цель достигается тем, что по способу определения дозы сенситина, необходимой для получения эритроцитарного диагностикума, путем анализа сенсибилизированных разными дозами сенситина эритроцитов, определяют среднюю электрофоретическую подвижность сенсибилизированных эритроцитов и используют дозу сенситина, при которой отношение электрофоретической подвижности к среднеквадратичному отклонению равно 0,8-0,160. Пример 1. Образцы двух партий эритроцитов баранов, фиксированных формалином и разведенных до 10%-ной суспензии физраствором, соединяют с равными объемами растворов полисахаридного антигена шигелл Зонне при концентрациях последнего 25-250 мкг/мл. Для проведения данной операции используют пробы объемом по 5 мл. Реакционные смеси выдерживают в течение 1 ч при 37°С. Затем сенсибилизированные эритроциты трехкратно отмывают от избытка антигена физиологическим раствором при рН7,2. Осадок разводят до первоначального объема (т.е. до 5 мл) раствором, содержащим: мясо-пептонный бульон Хоттингёра 25 об.%| сахароза 5 вес.%; боратно-янтарный буфер рН 7,5 остальное. Приготовленные пробные образцы лиофилизируют. Далее измеряют злектрофоретическую подвижность эритроцитов в пробных образцах. С этой целью их предварительно размачивают каждый в 5 мл дистиллированной воды, после чего центрифугируют в течение 5 мин при g 350. Полученные осадки сенсибилизированных р-азличными дозами антигена эритроцитов растворяют каждый в 6 мл измерительной среды с параметрами гнойная сила ;U.0,02 ;рН 7, 25 °С. Электрофоретическую подвижность измеряют методом микроэлектрофореза, на приборе ПАРМОКВАНТ-2 (Карл Цейсе, Йена) в режиме автоматического анализа электрофоретической подвижности (V)- и среднеквадратичное отклонение (ii ) в пробных образцах ста эритроцитарных клеток. .Затем рассчитывают отношениз V/-6 для каждого пробного образца. В табл, 1 дана характеристика пробных образцов эритроцитарного дизентерийного диагностикума Воине

.Таблица 1

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОЗЫ СЕНСИТИНА, НЕОБХОДИМОЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЩНАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА, путем анализа сенсибилизированных разными дозами сенситина эритроцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, определяют среднюю электрофоретическую подвижность сенсибилизированных эритроцитов и используют дозу сенситина, при которой отношение электрофоретической подвижности к среднеквадратичному отклонению равно 0,080,160,

Как видно из таблицы, для первой .партии эритроцитов минимальной сенсибилизирующей дозой, для которой отношение V/u находится в предлагаемом диапазоне, является 100 мкг/мл (при этой нагрузке отношение составляет 0,15). Поэтому данную дозу используют для получения целевого продукта (большие дозы применять нецелесообразно из экономических соображений, хотя для них коэффициент нагрузки и находится в предлагаемом диапазоне).

В результате сенсибилизации эритроцитов первой партии антигеном шигелл Зонне в дозе 100 мкг/мл с.последующим вьтолнением операций отмывки и лиофилизации в режимах, указанных вьШ1е для приготовления пробных образцов, получают сухой эритроцитарньй антигенный диагностикум дизентерии Зонне, имеющий титр в РИГА с сыворотками больных от 1/200 и выше, а с сыворотками здоровых доноров 1/2. При этом титр ,препарата в РИГА с иммунными кроличьими сыворотками составляет 1/6400.

Согласно табл. 1, для второй партии эритроцитов сенсибилизирующей дозой является 50 мкг/мл, так как при этой дозе V/6 0,08.

В результате сенсибилизации эритроцитов второй партии антигеном шигелл Зонне в дозе 50 мкг/мл получают диагностикум с титром в РИГА с сьтороткой больных от 1/100 и вьш1е с сыворотками здоровых доноров 1/2, а с имунными кроличьими сыворотками 1/3200..

Пример 2. Образцы двух партий эритроцитов баранов, фиксированных формалином и разведенных до 10%-ной суспензии физраствором, соединяют с равными объемами растворов полисахаридного антигена шигелл Ньюкэстл при концентрациях последнег 25-300 мкг/мл. Последующие операции ;по изготовлению и контролю пробных образцов.проводят, как описано в

примере 1. I

Результаты контроля пробных образцов приведены в табл. 2.

Таблица 2

V/cT

0,21

Из данных табл. 2 видно, что для обеих партий эритроцитов оптималь- , ной сенсибилизирующей дозой антигена шигелл Ныокзстл является 200 мкг/мл. Коэффициенты нагрузки эритроцитов данной дозой антигена равны О,ISH Oj16 соответственно,

В результате сенсибилизации бараньих эритроцитов обеих партий антигеном шигелл Ньюкэстл в дозе 200 мкг/мл получают эритррцитарный антигенньй диагностикум дизентерии Ньюкэстл, имеющий титр в РИГА с сыворотками больных 1/200-1/800, ас имунными кроличьими сыворотками ч 1/6400.

В результате применения предлагаемого способа упрощено и ускорено

Продолжение табл.2

0,11

0,13

0,17

определение точной дозы сенситина, используемой для сенсибилизации эритроцитов при получении диагностикма, за счет исключения необходимости испытания пробных образцов препарата с труднодоступными сыворотками больных; экономится дорогостоящее сьфье (сенситин) благодаря точному и быстрому определению величины сенсибилизирующей дозы (поскольку ранее приходилось преднамеренно завышать сенсибилизирующую дозу антигена для обеспечения гарантии в отношении чувствительности диагностикума);-повышена культура производства за счет аппаратурного оснащеНИН и количественного выражения процесса сенсибилизации.