Способ определения микробной резистентности организма Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено для объективного контроля за эффективностью лечения лекарственными препаратами, обладающими иммуностимулирующими свойствами, санаторно- курортными факторами и другими способами лечения, для определения индивидуального уровня антимикробной резистентности организма при различных физиологических и патологических состояниях, прогнозирования индивидуального уровня изменения неспецифической антимикробной резистентности организма при лечении больных, а также в других областях медицины.

Целью изобретения является упрощение и повгпчение точности способа за счет, оценки суммарной антимикробной активное ги гуморальных и клеточных факторов по их способности бло-;

киров ть активность микробного антигена, объективного контролирования эффективности лечения.

Способ осуществляется следующим образом.

В центрифужную пробирку к 0,1 мл крови, стабилизированной гепарином из расчета 50 ЕД/мл, добавляют 0,1 мл раствора активностью 8,0 и более АЕ/0,1 РТПГА микробного антигена ши- гелл Зонне, Нькжестл или Флекснера, встряхивают, инкубируют при 36-37°С в течение 10-15 мин. Смесь охлаждают 15-30 мин при 3-7°С. К пробам приливают по 0,5 мл раствора иммунной сыворотки, специфичной к антигену титром 3,0 и более в РПГА. Раствор иммунной сыворотки готовят из 1,0 мл неадсорбированной иммунной сыворотки к шигеллам Зонне, Ньюкестл или Флекснера, приложенной для контрольО5Јь

О

с&

СП ND

ных исследований к соответствующему эритроцитарному диагностикуму. С этой целью 1,0 мл сыворотки разводят в 5,0 мл физиологического раствора и для осаждения конгломератов этой сыворотки ее центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок удаляют, а надоеадочный раствор иммунной сыворотки разводят в 100 200 мл физиологического раствора. Одномоментно ставят шкалу, позволяющую оценить активность антигена,блокированного исследуемой кровью. К 0,1 мл микробного антигена различной активности с целью уравнивания приливают по О,1 мл физиологического раствора. Контролем является проба с 0,2 мл физиологического раствора. К пробам крови с остаточной активностью антигена и различных разведений этого антигена в контрольных исследованиях приливают по 0,5 мл приготовленного раствора иммунной сыворотки. Пробы встряхивают и инкубируют при 3-7 С в течение 20-30 мин, центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин Надосадочный раствор каждой пробы переносят в отдельные лунки 1-го ряда планшета для макроварианта постановки РПГА. В лунки этого ряда и последующих рядов приливают по 0,5 м физиологического раствора и раститро вывают сыворотку каждой пробы по вертикальному ряду лунок планшета, так, что в 1-й лунке ее разведение будет 2-кратное,.во 2-й - 4-кратное и т.д. до 4-5-го горизонтального ряда лунок планшета и добавляют в каждую лунку по 0,20-0,25 мл 1%-ной взвеси эритроцитов антигенного диагностику- ма. С учетом, что при исследовании антимикробной активности крови всегда проводят кoнfpoльныe исследования определяют активность антигена и иммунной сыворотки - диапазон колебаний времени и инкубации планшетов может быть значителен и составляет соответственно от 2 до 24 ч, температура 5-20°С.

Учет реакции проводят по 4-крест- ной системе: 4+ ;- все эритроциты агглютинированы и равномерно покрывают дно лунки:

3+ - агглютинированы почти все эритроциты, но на их фоне имеется малозаметное кольцо из осевших неагглютинированных эритроцитов;

5

0

5

0

5

0

2+ - наряду с равномерным агглю- тинатом на дне лунки имеется осадок из неагглютинированных эритроцитов - в виде маленького колечка;

1+ - большинство эритроцитов не агглютинировано и осело в виде маленького колечка в центре лунки.

С учетом, что картина агглютинированных и осевших эритроцитов в лунках четкая, при оценке результатов исследований между 4+ и 3+, 3+ и 2+ дополнительно выделяют 3,5+ и 2,5+. Между 2+ и 1 + , 1+ и - соответственно 1,5+ и 0,5+. Такой учет результатов не вызывает трудностей. Однако эта модификация резко повышает точность количественной оценки результатов взаимодействия крови с антигеном.

В дальнейшем кресты, отражающие активность иммунной сыворотки,вступившей в контакт с остаточной активностью антигена в пробах с исследуемой кровью и различными разведениями этого антигена в контрольных пробах с физиологическим раствором различных лунок по вертикальному ряду планшета складывают и получают относительную величину ее активности в +. Из полученных сумм высчитывают остаточную активность иммунной сыворотки в + после ее взаимодействия с исходным раствором, антигена и получают величину активности антигена, блокированного исследуемой кровью или иммунной сывороткой в контрольных пробах в + или АЕ/0,1 в РТПГА.

С учетом, что в микробиологии активность антигена оценивается в основном в АЕ в РТПГА, оценку активности крови можно проводить по формуле

45

С« х А.

4

0

5

где A j - активность антигена в АЕ/ /1,0 мл в РТПГА, блокированного исследуемой кровью; С ( - остаточный титр иммунных антител после взаимодействия с антигеном в пробе с

кровью в +;

i

А2 - исходная активность микробного антигена в АЕ;

Cg. исходный титр иммунных антител в +;

Способ иллюстрируется следующими примерами.

5164

Пример 1. Влияние дибазола на антимикробную реэистентность организма у детей.

Исследование антимикробной активности крови проводили у 13 детей, длительно и часто болеющих, 6-летнего возраста до и после 4-недельного курса лечения дибазолом (иммуностимулятор) в дозе 0,005 1 раз в день в поликлинических условиях по выше- описанной методике с использованием О,1 мл раствора антигена шигелл Нькжестл, активностью 13,5 АЕ/0,1 в РТПГА.

После инкубации О,1 мл крови с антигеном при 37°С в течение 10 мин пробы охлаждали при 3°С в течение 20 мин, приливали к пробам по 0,5 мл иммунных антител к шигеллам Ньюкестл титром 16/ в 0,5 мл в РПГА. Пробы встряхивали и снова выдерживали при 3°С в течение 20 мин, центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин и 0,5 мл надосадочного раствора проб перено- сили в планшет для макроварианта постановки РПГА и определяли активность блокированного антигена кровью де- тей в АЕ/0,1 РТПГА.

Средняя величина активности блокированного антигена кровью детей до лечения составляет 3,1 АЕ/0,1 в РТПГА. Однако отмечаются значительные индивидуальные вариации этого показателя - в диапазоне от 1,0 до 4,0 АЕ С ± 16 3,1±0,9 (36 ±0,27) После проведенной терапии дибазолом отмечается статистически достоверное повышение уровня антимикробной актив- ности крови у детей (,05), на +32%. В то же время установлена обратная зависимость между исходными величинами антимикробной активности крови у детей и изменениями их уров ней после лечения дибазолом (г -0,88 + 0,07, ,01),

Таким образом, результаты исследований позволяют объективно контролировать эффективность лечения и прог- позировать изменения индивидуального уровня антимикробной резистентности организма у детей: с относительно низкими исходными уровнями антимикроной активности крови (3,0 АЕ и ниже) отмечается значительное повышение ее уровня и, наоборот, с высокими (3,5 АЕ,и выше) отмечается незначительное повышение, изменение не вы

5

20

Q

25

30

до 45

50 55

35

является или отмечается незначительг ное снижение этого показателя крови

Заявляемый способ позволяет с высокой достоверностью прогнозировать уровень изменения антимикробной резистентности организма конкретного ребенка до начала лечения, что позволяет обеспечить индивидуалыый подход при проведении терапии иммуностимуляторами в поликлинических условиях и проводить объективный контроль за эффективностью лечения.

Л р и м е р 2. Изменение антимикробной резистентности организма у детей под влиянием лечения липамидом и поливитаминами.

Обследована группа детей в возрасте 3-х лет 7 человек) из дома ребенка № 1 г. Перми. Особенность этой группы - дети закрытого коллектива с энцефалопатиями смешенного генеза. Исследование антимикробной активности крови проводили до и после лечения поливитаминами и липамидом в течение 2-х недель по вышеописанной методике с использованием антигена шигелл Ньюкестл активностью 10 АЕ/ /0,1 мл в РТПГА. После взаимодействия 0,1 мл крови с антигеном диаг- ностикума при 36°С в течение 15 мин смесь охлаждали при 7°С в течение 30 мин, приливали 0,5 мл иммунной сыворотки шигелл Ньюкестл титром 16 в 0,5 РПГА, пробы встряхивали и допол.- нительно выдерживали при 7°С в течение 30 мин, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин,надоса- дочный раствор проб переносили в планшет и определяли активность блокированного кровью антигена в АЕ/0,1 РТПГА.

Средняя величина блокированного антигена кровью детей до лечения составляет 3,3 АЕ, индивидуальные величины этого показателя .колеблются от 2,0 и 4,5 АЕ. М±б 3,3±0,9 (3 ±0,27). После проведения лечения отмечается статистически достоверное повышение уровня антимикробной активности крови у детей (,05), на + 27%. В то же время установлена обратная зависимость между исходными величинами антимикробной активности крови у детей и изменениями их уров ней под влиянием лечения (г -0,55 + 0,13, ,05), что позволяет, как и в первом примере,проводить объективный контроль за эффективностью лече-

ния и прогнозировать изменения антимикробной резистентности организма под влиянием лечения детей липамидом и поливитаминами: с относительно низкими уровнями антимикробной активности крови (3,5 АЕ и ниже) отмечается, как правило, значительное повышение ее уровня и, наоборот,при высокой исходной величине антимик- робной активности крови (4,0 АЕ и выше) из 6 детей только у одного ребенка отмечается повышение этого показателя, у двух детей изменений не выявлено, а у трех - наблюдается снижение его уровня.

Приведенные результаты исследований антимикробной активности крови у детей под влиянием лечения липамидом и поливитаминами убедительно показывают возможность проводить объективный контроль за эффективностью лечения и прогнозировать ее изменение.

П р и м е р 3. Изменение антимикробной резистентности организма у детей под влиянием лечения в санато

рии Светлана г.Перми.

Обследована группа детей (27 человек) в возрасте от 3 и 7 лет до начала лечения и в динамике через 4 недели после лечения в детском санатории Светлана г. Перми с использованием методики исследования антимикробной активности крови. К 0,1 мл крови приливали 0,5 мл антигена ши- гелл Ньюкестл активностью 16 АЕ/0,1 мл в РТПГА. Пробы выдерживали 13 мин при 36,5°С, охлаждали при 5 С в течение 25 мин, приливали по 0,5 мл иммунной сыворотки к шигеллам Ньюкестл титром 16 АЕ/0,5 в РПГА, пробы встряхивали, снова выдерживали при низкой температуре (5°С) в течение 25 мин.Пробы центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость в количестве 0,5 мл переносили в планшет и определяли активность блокированного антигена исследуемой крови в АЕ/0,1 мл в РТПГА.

Средняя исходная величина активности блокированного антигена кровью у детей до начала лечения составляет 4,6 АЕ, индивидуальные колебания этой величины равняются в диапазоне от 2,0 до 9,0 АЕ М±6 4,6il,7 (36 i5,l). Через 4 недели после лечения отмечается статистически достоверное повышение уровня антимикробной активности крови у детей (,05)

Q j

0

5

15

0

15

50

55

на +39%. В то же время отмечается обратная зависимость между исходными уровнями антимикробной активности крови доноров и изменения этих величин после лечения (г -0,56iO,13, ,05).

Результаты исследований позволяют сделать вывод о возможности объективного контроля за эффективностью лечения детей в санатории и прогнозирования индивидуальных изменений антимикробной активности крови с использованием заявляемого способа: из 12 детей с относительно низкими уровнями антимикробной активности крови (4,0 АЕ и ниже) у 10 отмечается значительное повышение ее активности и только у 2 не выявляется существенное изменение этого показателя и, наоборот, у 15 детей со средними и высокими уровнями антимикробной активности крови (4,5 АЕ и выше) у 4 отмечается снижение, у 3 существенных изменений не выявлено, у 8 детей отмечается несущественное повышение этого показателя.

Как было отмечено выше, при исследовании антимикробной активности крови в качестве стабилизатора использовали гепарин в дозе 50 АЕ/мл крови, при снижении дозы препарата до 20 - 30 АЕ/мл у ряда здоровых доноров и детей отмечалось частичное свертывание крови. Достаточным является объем 0,1 мл крови, снижение его до 0,05 мл снижает воспроизводимость способа. Активность антигена шигелл Зонне, Ньюкестл или Флекснера ЛНИИБС составляет 3,0 и более АЕ/0,1 мл в РТПГА.

В этой дозе антиген полностью блокирует активности гуморальных и клеточных антимикробных факторов цельной крови и частично сохряняет свою активность в отношении индикаторной дозы иммунной сыворотки, используемой для определения активности антигена, блокированного кровью.

Оптимальная температура инкубации крови и антигена составляет 36-37°С. Основанием для использования этой температуры обработки смеси является энергозависимость процесса взаимодействия крови с антигеном,косвенным доказательством которой является снижение величины блокированного антигена цельной кровью при 3-13°С.

Для выявления индивидуальной разницы антимикробной активности исследуемой крови оптимальное время обработки смеси составляет 10-15 мин. Увеличение времени инкубации снижает эту разницу. Этот эффект связан иммуностимулирующими свойствами индикаторной дозы антигена в отношении активности антимикробных факторов крови. В связи с этим при увеличении времени обработки смеси при 37°С более чем 15 мин резко снижается индивидуальная разница в антимикробной активности крови у доноров или детей.

Результаты исследований полностью подтверждают литературные данные о возможности некоторых микробов и их субстанций (БЦЖ и липополисахаридов) стимулировать активность клеточных факторов иммунитета.

После взаимодействия крови с антигеном пробы охлаждают до 3-7 С. В литературе известны данные, полученные на модели исследования фагоцитарной активности лейкоцитов, что при низкой температуре отмечается снижение и даже полное прекращение метаболических процессов в клетках крови, следствием которого является угнетение или полное прекращение антимикробной активности этих клеток. В то же время сохраняется способность антигена вступать во взаимодействие с иммунными антителами, используемая для индикации остаточной активности этого антигена.

В результате исследований установлено, что индикаторная доза иммунных антител в титрах при определении остаточной активности антигена в пробах с кровью составляет 8,0 и более в 0,5 мл в РПГА. Время контакта при 3-7°С антигена с иммунными антителами достаточно 20-30 мин. Как показали исследования, к этому сроку наблюдается полная блокада активности антигена иммунными антителами в пробах с кровью.

Для определения неспецифической антимикробной активности крови использованы взвеси микробов шигелл Зонне, Ньюкестл и Флекснера или взвеси антигенных эритроцитарных диагнос тикумов из этих микробов. Основанием для использования антигенов дизентерийной -группы микробов являются полученные с использованием заявляемого

5

0

5

0

5

0

5

0

5

способа результаты исследований: прямая корреляционная связь между индивидуальными уровнями антимикробной активности крови к этой группе микробных антигенов.

Несмотря на значительные индивидуальные колебания антимикробной активности крови к антигенам ни елл Зонее. Ньюкестл отмечается высокая прямая корреляционная связь между уровнями активности блокированного антигена этих микробов (г +0,95± ±0,04 ,01).Аналогичная прямая корреляционная связь выявлена между уровнями антимикробной активности крови доноров к антигенам шигелл Зонне и лекснера, шигелл Ньюкестл и Флекснера (,05).

Преимущества способа определения антимикробной активности крови по ее способности блокировать активность микробного антигена заключаются прежде всего в том, что эта методика отражает интегральный результат взаимодействия крови с антигеном - позволяет оценить способность гуморальных и клеточных компонентов крови снижать активность микробного антигена. Показатель антимикробной активное-. ти цельной крови на 4/5 состоит из величины блокированного антигена гу- моральным компонентом крови, около 1/5 приходится на клеточные элементы крови - эритроциты, лимфоциты,фагоциты. Величина фагоцитированного антигена в антимикробной активности крови составляет не более 5%. В то же время методика оценкифагоцитйр- ной активности лейкоцитов отражает, как правило, уровень фагоцитоза 100 - 200 поли- и мононуклеарных фагоцитов.

Заявляемый способ отличается высо-1 кой точностью - средняя ошибка не превышает 5%, высокой воспроизводимостью, составляющей практически 100% в сравнении с методикой оценки фагоцитоза,которая по мнению большинства исследователей в фазе подсчета имеет ряд недостатков: субъективна, недостаточно точна и воспроизводима .

Важным преимуществом заявляемого способа является и высокая производительность труда. Для оценки результатов исследований требуется ке более 1 мин. Для подсчета в 1 мазке количества объектов, фагоцитированных

100-200 лейкоцитами, необходимо около 30 мин - 1 ч.

В заявляемом способе не требуются растворы для фиксации и покраски маз- г ков.

Сравнительная оценка различных способов определения антимикробной ре- зистентности организма показана в таблице.Ю

Заявляемый способ может конкурировать по точности исследования антимикробной резистентности с радиоиммунными методами. Однако в нем не J5 требуется меченых радиоактивным изотопом микробных взвесей. Определение антимикробной активности цельной крови проводится с использованием стандартизованных, доступных, выпускав- 20 мых отечественной промышленностью микробных антигенов дизентерийной группы микробов и прилагаемых к ним иммунных сывороток.

С учетом высокой точности,объек- 25 тивности, высокой воспроизводимости и производительности труда при исследовании антимикробной резистентности организма заявляемый способ рекомендуется в практическую медицину для объективного контроля за эффективностью лечения лекарственными препаратами, обладающими имму но стимул ируо- щими свойствами, и другими способами лечения,прогнозирования неспецифической антимикробной резистентности организма . Формула изобретения

Способ определения микробной резистентности организма путем внесения в пробу цельной крови микробного антигена с последующей оценкой результатов взаимодействия компонентов крови с антигеном, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, в пробу цельной крови вносят антиген с избыточной активностью, инкубируют затем вносят специфические к антигену иммунные антитела, повторно инкубируют с последующим центрифугированием смеси, отделением надосадочной жидкости и определением в ней остаточной активности внесенного антигена в реакции торможения пассивной гемагглютинашш.

Способ определения неспецифической антимикробной резистентности организма относится к иммунологии. Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа. Указанная цель достигается путем взаимодействия цельной крови с микробами.Новизна способа заключается в том, что в качестве микробных субстанций используют микробный антиген в дозе 8,0 и более АЕ-0,1 в РТПГА,смесь инкубируют при 36-37°С в течение 10-15 мин, охлаждают в течение 20-30 мин при 3-7°С, добавляют 0,5 мл иммунной сыворотки активностью 3,0 и более АЕ/0,5 в РПГА,специфичнои к антигену, инкубируют при 3-7°С в течение 20 - 30 мин, центрифугируют, переносят 0,5 мл надосадочной жидкости в планшет и определяют антимикробную активность крови по остаточной активности антигена в АЕ/0,1 РТПГА. 1 табл. с SS (Л

т

ки

100-200 поли- и моно- нуклеарных фагоцитов

низкая

низкая

для подсчета количества объектов фагоцитоза в 100-200 лейкоцитах требуется около 30 мин - 1 ч требуются

антител (80%), эритроцитов (15%) и не более 5% приходится на долю фагоцитов

ошибка составляет не более

практически 100% не более 1 мин

нет