Способ иммунодиагностики Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

00 GfS. О Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использован для иммунодиагностики путем выявлен специфической реакции крови на антиген и установления по ней природы агента, вызвавшего забол вание . Известен способ иммунодиагностик путем определения в реакции иммуноприлипания иммунных антител по их взаимодействию с растворимыми или корпускулярными антигенами и фиксации этих комплексов на поверхности эритроцитов LI. Однако известный способ не позво ляет осуществлять диагностику в ран ние сроки заболевания. Известен также способ иммунодиаг ностики путем определения антигенсвязывающей активности эритроцитов 21. Однако известный способ недостаточно точен, поскольку при исследовании одной пробы сыворотки больного величина антигенсвязывающей акти ности может оказаться различной изза индивидуальных различий опсонической силы крови здоровых людей. В результате диагностически значимы ми признаются лишь высокие величины связывания. Кроме того, способ позв ляет осуществлять диагностическое исследование не ранее 5-6 дня заболевания . Цель изобретения - повьш1ение точ ности диагностики у каждого конкрет ного больного и сокращение сроков диагностшси. Указанная цель достигается тем, что согласно способу иммунодиагностики путем определения антигенсвязывагащей активности эритроцитов, одновременно определяют с момента возник новения заболевания связывание специфического и неспе1щфического (конт рольного) антигенов эритроцитами крови больного и здорового человека и по соотношению величин, выражающих отношение связывания специфического антигена эритроцитами крови больного и связывания -специфического антигена эpитpoцитa ш крови здорового человека, а также отношение связывания неспецифического антигена эритроцитами крови больного и связывания неспе цифического антигена эритроцитами крови здорового человека, вычисляют индекс специфического связывания антигена. Способ осуществляется следующим образом. У больного берут из вены кровь и стабилизируют ее антикоагулянтом. В день исследования получают свежую донорскую кровь, стабилизированную аналогичным образом. Оба образца крови одновременно центрифугируют, удаляют плазму, а эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором .хлористого натра. Делят кровь на порции в соответствии с количеством антигенов , взятых для исследования. Смешивают равные объемы отмь. гой эритроцитарной массы и раствора антигена активностью 3-4 антигенные единицы на мл, определяемой в РТПГА. Все про6bf одновременно помещают в термостат на 20-25 мин, центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость. Эритроциты однократно отмывают физиологическим раствором. Определяют количество связанного эритроцитами антигена по его остаточной активности в надосадочной жидкости по сравнению с исходной активностью антигена в рабочем растворе или путем непосредственного определения активности адсорбированного на эритроцитах антигена. Для определения активности антигена смешивают раствор антигена или эритроцитарную массу с равным объемом иммунной сыворотки активностью в 8-16 гемагглютинирующих единиц, определяемой в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Смесь помещают в термостат на 1 ч и определяют гемагглютинирующую активность сыворотки по обычной схеме определения титра антител в РПГА. По уменьшению активности сыворотки в сравнении с ее рабочим титром устанавливают степень нейтрализующего действия антигена. Для количественной оценки связывания антигена эритроцитами готовят стандарты РТПГА с рабочим раство- ром иммунной сыворотки и с убывающими количествами антигена от 4 до 0,25 антигенных единиц. По стандартам рассчитывают величину связывания антигена эритроцитами. Вычисляют индекс специфического связывания антигена по формуле

Величина связывания специфического антигена эритроцитами крови больного

Индекс ССА Величина связывания специ фического антигена эритро цитами крови здорового че ловека У здоровых лиц и лиц контрольной группы величийа индекса специфическо го связывания антигена (ССА) не превышает 1,30. Превышение этой величины принимают за достоверный признак спе1ц-1фической реакции крови и соответственно оценивают ее диагностичес кую значимость. Пример 1. У двух больных ост рой кишечной инфекцией (2-й и 3-й день болезни) берут из вены кровь в количестве 5 мл, стабилизируют гепарином из расчета 0,02 (50 ME) мл на 1 мл. Таким же образом берут в день исследования кровь донора. Пробы крови одновременно центрифугируют 10 мин со скоростью 1500 об/мин, отсасывают плазму (можно с поверхностным слоем лейкоцитов) , а эритроид тар ную массу трижды отмывают физиологическим раствором в объеме 10 мл, каж дый раз центрифугируя и отсасывая надосадочную жидкость. Из каждой про бы крови берут три порции эритроцита ной массы по 0,6 мл и помещают в центрифужные пробирки. В каждую пробирку приливают равный объем рабочих растворов антигенов шигелл Зонне, Флекснера и сальмонелл тифимуриум, полученных из надосадочной части центрифугатов соответствующих коммерческих бактериальных диагностикумов. Активность рабочего раствора антигенов составляет 3 антигенных единицы(АЕ)при определении в РТПГА в соответствии с Наставлением по применению эритро цитарных диагностикумов из Шигелл дизентерии и сальмонеллёзных О эритроцитарных диагностикумов. Все про бирки одновременно помещают в термостат при 37°на 20 мин и периодически- их встряхивают, центрифугируют 15 мин со скоростью 1500 об/мин, отсасывают надосадочную жидкость, определяют в ней количесвто оставшегося антигена. Для этой цели к 0,5 мл соответствующей иммунной сыворотки активностью 16 гемагглютинируюшд-ix единиц (ГЕ) добавляют 0,5 мл раствора антигена, контактировавшего

Величина связывания неспецифического (контрольного) антигена эритроцитами крови больного еличина связывания неспецифического (контрольного) антигена эритроцитами рови здорового человека с эритроцитами, вьщерживают смесь в термостате 1 ч и определяют геммагглютинирующую активность сыворотки, производя 4 последовательных разведения в 0,5 мл физиологического раствора. Добавляют по 0,25 мл соответствующего эритроцитарного диагностикума и оценивают реакцию через 2,5 ч. Оценку реакции производят по общепринятой системе 4-х крестов. Для количественного определения антигена в пробах готовят стандарты РТПГА с рабочим раствором иммунной сыворотки активностью 16 ГЕ и раствором антигена активностью от А до 0,25 АЕ. Каждую пробу титруют по приведенной схеме. Величину связывания антигена эритроцитами вычисляют по разнице ме;кду его исходной активностью в рабочем растворе и остаточной актипностью после контакта с эритроцитами. Определив величины связывания всех антигенов в пробах с эритроцитами крови больных и ЗДОРОВОГО человека, вычисляют индексы специфического связывания. В табл. 1-3, представлены результаты исследования антигеисвязывающей активности эритроцитов крови больных острой кишечной инфекцией. Представленные данные иллюстрируют особенности оценки показателя связывания и расчета индексов специфического связывания. Табл. 4 содеряа1т итоговые результаты исследования в сопоставлении с данными клииико-бактериологического исследования. У обеих больных, по результатам определения антигенсвязывающей активности эритроцитов, было сделано заключение о наличии у них дизентерии и, с учетом большей величин индекса в отношении одного из типов дизентерийных антигенов,у первой больной предполагали наличие дизентерии Флекснера, а У второй - Зонне. Представленное заключение опередило результаты бактериологического исследования соответственно на 3 и 2 дня. Особенно обращают на себя внимание данные исследоS11вания у больной С,, у которой абсолютная величина связывания обоих дизентерийных антигенов по отношению к их связыванию у здорового человека не была повыи1енной. Тем не менее расчет индексов специфического связывания дал очень четкие результаты,

1) Стандарты РТПГА для оценки активности антигена Флекснера в реакции с поливалентной неадсорбированной иммунной сывороткой Флекснера

Таблица 1 9 обнаружив у этой больной ясную специфическую реакцию крови по отношению ; к дизентерийным антигенам. Связывание антигена Флекснера эритроцитами крови больныхх кишечной инфекцией и крови здорового человека

СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ путем определения антигенсвязывающей активности эритроцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности диагностики у каждого конкретного больного и сокращения сроков диагностики, одновременно определяют с момента возникновения заболевания, связывание специфического и неспецифического (контрольного) антигенов эритроцитами крови больного и здорового человека и по соотношению величин, выражающих отношение связывания специфического антигена эритроцитами крови больного и связывания специфического антигена эритроцитами крови здорового человека, а также отношение связывания неспецифического антигена эритроцитами крог ви больного и связываниг иеспецифического антигена эритроцитами крови (Л здорового человека, вычисляют индекс специфического связывания антигена.

Сыв,+физ.р-р

++++ ++++ ++++ +++

Сыв,+4 АЕ антигена Флекс2) Оценка связывания антигена Флекснера эритроцитами по величине остаточной активности антигена после контакта с эритроцитами (исходная активность антигена - 3 АЕ)

Ингредиенты 1Разведения в физ. растворе сыв.+антиген

Здорового

++++ ++(+) челся ека

+НКоличество оставшегося и свяОсталось 2 АЕ Связалось 1 А ИнгредиентыРазведения в физ.растворе сыв.+антиген после контакта с эритроцитами

Больной К. ++++ ++++ +++ + Больной С. ++++ ++ (+) ц

Продолжение таблицы

Осталось 0,75 АЕ Связалось 2,25 АЕ

Осталось 2.3 АЕ Связалось 0,5 АЕ Прнмечание: прИ наличии реакции двумя смежными концентрациями антигена в расчет бе рется средняя между ними величина активности антигена. ние антигена Зонне эритро- цией и крови здорового человеови больных кишечной инфек- ка 1) Стандарты для оценки активности антигена Зонне в РТПГА с адсорбированной иммунной сывороткой Зонне Ингредиенты Разведения в физ. растворе Контроль Т:Т Т:Т ГТ:Т Т: 8 ТТ:Тб 11111 Сыв.+физ.р-р++++++++++++++++ ++ Сыв.+З АЕ антигена Зонне-(+++++ Сыв.+2 АЕ++++++++++- Сыв.+1 АЕ+++++++++++++ Сыв. +0,50 АЕ+++++++++++++++ Сыв.+0,25 АЕ++++++++++++++++ 2) Оценка связывания антигена Зонне по величине его остаточной активности после контакта с эритроцитами (исходная активность антигена - 3 АЕ) Ингредиенты- Разведения в физ. растворе Количество сыв.+антигент1гг-оставшегося послеконтак- 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 и связанного та с эритро-антигена цитами крови Здорового человека ++++ ++++ ++ - - Осталось 2 АЕ Больной К. ++++ ++++ + - - Осталось 2 АЕ Больной С. ++++ ++++ ++ - - Осталось 2 АЕ Количество оставшегося и связанного антигена Т а б л и ц а 2 Связалось 1 АЕ Связалось 1 АЕ Связалось 1 АЕ

9110786910

Связывание антигена сальмонелл ных кишечной инфекцией и кро тифимуриум эритроцитами крови боль- вого человека 1) Стандарты для оценки активности сальмонеллезного

антигена в РТПГА с неадсорбированной сельмонеллезной сывороткой к сальмонеллам тифимуриум

Ингредиенты

Разведения в физ. растворе

1:1

физ. раст++-f+

-«-З АЕ онел. ан+++а

+2 АЕ ++++

+1 АЕ ++++

+0,5 АЕ

++++

+ 0,25 АЕ ++++ Рас связыв кровиздоро

Таблица 3

Контроль

1:4

1 :8

1:16

++++ ++++ ++-(-+

+ ( + ) ++(+)

++ +

++++ +++

++ 2) Оценка связывания сальмонеллезного антигена по величине его остаточной активности после контакта с эритроцитами (исходная активность антигена - 3 АЕ) Сыв. + антигенРазведения в физ. растворе Количество оспосле контакта тавшегося и свяс эритроцитамиванного антигена крови1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 Здорового человека ++++ ++ Осталось 1,5 АЕ Больной К. ++++ +( + ) - - - Осталось 2 АЕ Больной С. (+) - - Связалось 0,5 АЕ чет индексов специфического Индекс ССа для антигена Зонне по ания антигенов эритроцитами отношению к сальмонеллезному антибольной к.тему. Связалось 1,5 АЕ Связалось 1 АЕ Осталось 2,5 АЕ .1 АЕ, Индекс ССА ,5 АЁ Индекс специфического связывания для-aHrrfreHa Флекснера по отношению к сальмонеллезному антигену. --. 2.25 АЕ 1 АЕ Индекс сСА - - -:---- 3,37. Расчет индексов специфического связывания антигенов эритроцитами крови больной С. Результаты определения антиген .эритроцитов и клинико-бактериолог у больных кишечной инфекцией

Больная.К.

2-й 100 225 67 1,50 3,37

Больная С.

3-й 100

50 П р и м е р 2 подтверждает возможность применения предлагаемого /:способа при диагностике вирусных и риккетсиозных инфекций. Пример 2. В этом варианте применения способа производят до эта па связывания антигена эритроцитами те же действия, что и при диагностике дизентерии. Для определения связы вания вирусного антигена к отмытым эритроцитам добавляют раствор соответствующего вирусного гемагглютинина и определяют количество связавшегося антигена гго его остаточной активности в реакции гемагглютинации (РГА), проявляющейся в агглютинируюотнра ант I

Острая дизентерия типа Флекснера 2а, средней тяжести

1,50

Острая дизентерия типа Зонне, средней тяжести Индекс ССА для антигена Зонне по ошению к сальмонеллезному антигену Индекс CCAЦ™: |- 3,00 1 АЕ 1,5 АЕ Индексы ССА для антигена Флекснепо отношению к сальмонеллезному игену. Индекс АЕ 1,50. I Aij -5 Таблица вязывающей активности ческого исследования . щем действии вируса на эритроциты животных или человека. Из осадка отмытых эритроцитов крови больного и донора готовят 5%-ную взвесь отмытых эритроцитов в физиологическом растворе хлористого натра. К 0,5 мл взвеси эритроцитов добавляют равный объем раствора геммаглютинина вируса клещевого энцефалита, разведенного боратным буфером до активности в РГА с 1%-ной взвесью гусиных эритроцитов до 16-32 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ). В пробу, контролирующую специфичность реакции, добавляют такой же объем раствора вируса гриппа А, разведенного физраствором до активности в РГА с 1%-ной взвесью эритроцитов человека группы О до 32-64 ГАЕ. Все пробы выдерживают в термостате 10 мин, центрифугируют, отсасывают надосаточную жидкость и определяют в РГА остаточную активность вирусного гемагглютинина. Для тестирования активности гемагглютинина вируса клещевого энцефалита производят последовательные двукратные разведения 0,5 мл надосадочной жидкости в 0,5 мл физраствора до 1:32. В каждую лунку добавляют по 0,25 мл 1%-ной взвеси гусиных эритроцитов. В пробе с вирусом гриппа разводят материал до 1:64 и в каждую лунку добавляют по 0,25 мл 1%-ной взвеси эритроцитов крови человека нулевой группы. Реакцию читают через 1-2 ч после вьщерживания при комнатной температуре или в термостате. Реакцмо оценивают по системе четырех крестов, активность выражают в ГАЕ. При определении величины индекса специфического связывания гемагглюти нина вируса клещевого энцефалита эритроцитами крови здоровых людей

1) Гемагглютинирующая активность вируса клещевого энцефалита после контакта с эритроцитами крови больной и донора

++++ ++++ ++++ ++++

После контакта с эритроцитами больной

+++-I- ++++ ++++

Таблица

16

13,5 ГАЕ

2,5

7,5 ГАЕ

8,5 было установлено, что величина индек са не превышает 1,20. Цифры индекса выше этой величины можно считать диагностически значимыми. Пример, иллюстрирующий особенности оценки специфической реакции эритроцитов в отношении вирусного антигена, представлен в табл. 5.Как видно из таблицы, у больной наряду с усилением связывания антигена вируса клещевого энцефалита в сравнении с соответствующим показателем донора имеет место значительное снижение связывания контрольного антигена, т.е. реакция эритроцитов носит строго специфический характер, что безусловно подтверждает наличие у больной клещевого энцефалита. Существенно, что специфическая реакция эритроцитов выявлена в самом начале болезни . Связывание гемагглютинина вируса клещевого энцефалита и вируса гриппа эритроцитами крови больной клещевым энцефалитом и здорового человека Больная 0., 3-й день болезни.

2) Гемагглютинирующая активность вируса гриппа после контакта с эритроцитами крови

Рабочий

раствор++++++++ ++++ ++++ ++++

У больной++++++++ ++++ +++

У донора++++++++ + Примечание. После титра + оценивали в 0,5 ГАЕ, Расчет индекса специфического свя зывания антигена вируса клещевого энцефалита. 13,5 16 13,5 27,5 „ .„ Имп РТСР -i- - -: - .-.-г Ч 111 Индекс 7,527,5 7,5 16 подтверждает высокую диагностическую значимость исследования антигенсвязывагощей активности эритроцитов у этой больной. Результаты проведенного исследования хорошо иллюстрируют преимущест ва предлагаемого способа иммунодиагностики перед известными. Действительно, у больных была выявлена специфическая реакция крови и соответст венно сделано верное диагностическое заключение в такой ранний период заболевания (2-й и 3-й дни), когда это невозможно сделать с применением известных способов иммунодиагностики Второе преимущество способа выявляет ся в том, что, несмотря на большое количественное различие в абсолютных уровнях связывания специфического антигена у каждой больной, в обоих случаях удалось выявить индивидуально высокую специфическую реакцию эритроцитов, очень близкую по показа телям ее относительного прироста (индекс специфического связьгоания антигенов соответствующего вида шигелл - 3,37 и 3,30). При применении известных критериев оценки специфической реакции по абсолютной величи не связывания антигена эритроцитами

32

16 16 ГЛЕ 4,5 27,5 ГАЕ у больной с. выявить специфическую peaкцIiio крови не удалось бы. - Согласно Наставлению по применению диагностикумов зритроцитарных из Шигелл дизентерии Министерства здравоохранения РСФСР РПГА исследуют для уточнения диагноза не ранее 5-6 дня болезни. По данным испытаниям способа в городской инфекционной больнице № 1 г.Перми, исследование крови по предлагаемому способ - позволяет диагностировать дизентерию не позднее 2 дня болезни, т.е. на 3-4 дня раньше, чем это возможно при постановке РПГА. Эффективность предлагаемого способа особенно значительна в первую неделю заболевания дизентерией. По данным акта испытания в период с 2 по 7 дни заболевания положительное диагностическое заключение было получено у 12 из 14 обследованных больных (85,7%). По данным литературы на первой неделе заболевания дизентерией антитела обнаруживаются в РПГА в диагностическом титре лишь у 10% больных. Следовательно, на первой неделе заболевания предлагаемый способ в восемь раз эффективнее РПГА. Он эффективнее РПГА и в относительно поздние сроки заболевания, когда происходит накопление в крови достаточного количества иммунных антител. В акте испытания, представленном Пермской ОблСЭС, содержатся материа