Способ определения гомосерина Советский патент 1982 года по МПК G01N31/08 

(54) СПОСОБ ОПгеДЕЛЕНИЯ ГОМОСЕРИНА

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определе ния гомосерина. Известен способ определения гомосе- рина методом тонкослойной хроматографии на силуфоловых пластинках, основанный на различной степени средства аминокислот к неподвижному носителю i. Недостатком способа является малая точность и длительность анализа (3-6 ч) Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ количественного определения аминокислот, в том числе гомосерина газожидкостной хроматографией (ГЖХ) летучих Ы -трифторацетилметиловых эфиров аминокислот, получаемых реакцией ацетипирования аминокислот триэтанопамином и метиптрифторацетатом в метаноле 2. Недостатком способа является малая точность и длительность анализа (4-5 ч) Цепь.изобретения - повышение точности определения и сокращение времени про ведения анализа. Поставленная цель достигается тем, что, согласно способу определения гомосе- рина, включающему газожидкостную хроматографию летучих производных гомосерина анализируемую пробу обрабатывают трифторуксусным ангидридом в ацетоне при 15-30°С н в случае определения синтетического гомосерина дополнительно обрабатывают диазометаном с последующей газожидкостной хроматографией образующихся летучих производных. В качестве летучих производных используют N, 0-трифторацетилпроизводное гомосерина (при определении гомосерина в биологических объектах) или метиловый эфир N ,О-трифторацетилгомосерина (при определении гомосерина в синтетических продуктах). При определении гомосерина в биологических объектах N ,0-трифторацетилпроизводные гомосерина получают реакцией ацетилирования гомосерина трифторуксусным ангидридом при концентрации 5О - lOO мас.% в среде ацетона и температуре 15-30 С в течение 3-5 мин. При опредепении гомосерина в синтети ческом продукте N ,О-трифторацетиппроиз Бодное гомосерина получают реакцией аце тит1рования трифторуксусным ангидридом при концентрации 10-25 мас.% в среде ацетона при 15-30 С в течение 3-5 мин Метиповый эфир N,0-трифторацетипгомо- сернна получают метилированием диазоме таком в эфире & течение 0,5-2 мин, В качестве внутреннего стандарта при меняют высшие спирты и.эфиры моно-.и дикарбоновых органических киспот, Газохроматографический анализ проводят на любом типе хроматографа с ппаменно-ионизационным детектором. Хроматографическая колонка из нержавеющей отапи {50-ЗОО см длиной и внут ренним диаметром О,2-О,4 см) запопнена 0,5-6,0%-ной полиэфирной жидкой фазой на инертном носителе, например полиэтиленгликольадипинат на хроматоне M-AW- HMD5-Газ-носитель - любой инертный газ, например азот. При опредепении гомосерина в продукте, полученном химическим методом, используют режим с линейным программированием при изменении температуры от 50 до 20ОС (I-IO С/мин) или изотермический при 120° С. При определении гомосерина в биологических продуктах используют режим с линейным программированием при изменеши температуры от 20 до 200°С (l-g Ю С/мин) или изотермический при 160С Относительная ошибка определения . При определении гомосерина в биологи ческих и синтетических продуктах, содержащих значительные количества примесей в частности нейтральные кисл(5ты и неорганические кисло1Ъ1, необходимо очищать ромосерин с помощью катионообменной смолы, например КУ-2-8 в Н -форме, элюируя гомосерин 4 н. раствором аммиака. Смола переводится в ЬТ -форму одним из обычных способов. Пример 1. Определение гомосеоина в модельных растворах, содержащих химически чистый гомосерин, в синтетическом гомосерине, полученном химическимо методом. Количественный анализ определения гомосерина проводят по высоте пиков на хроматограмме методом калибровки по описанной ниже методике. Для учета возможных механических потерь гомосерина при очистке проб с помощью ионообменных смол калибровочный график строят С использованием раствора химически чистой аминокиспоты, которая выделяется также ионробменнь1ми смолами в идентичных условиях. 5,ОООО г синтетического гомосерина взвешивают на аналитических весах с точностью до четвертого знака, растворяют дистиллированной водой в мерной копбе на 25 мл. 3 г подготовленного катионита влажностью 50% заливйют 1 мл пробы, добавляют 5 мл дистиллированной воды для лучшего перемешивания и проводят сорбцию аминокислоты в течение 15 мин при интенсивном перемешивании содержимого с помощью магнитной мешалки. Смолу, содержащую аминокислоты, промывают во взвешенном слое дистиллированной водой до рН 7. Катионит отделяют от жидкости на фильтре Шотта, .при этом хорошо отсасывают межчастичную воду. Содержание воды в смоле. 50%, что составляет 1,5 мл. Смолу количественно переносят в стакан, добавляют 2,5 мл 4 н. ЗH,JOH и проводят элюирование гомосерина в течение 15 мин. После оседания смолы надосадочный раствор объемом 1 мл вносят в колбу с притертой йробкой для упарива - ния. К остатку добавляют 0,5 мл 1О%-ного раствора трифторуксусного ангидрида в ацетоне. Реакцию ацетилирования проводят в течение 5 мин при . Остаток реагентов удаляют холодным воздухом в течение 5 мин. К остатку добавляют 1 мл диазометана, встряхивают в течение 0,5 мин, удаляют диазометан холодным .воздухом, добавляют 1 мл О,2%-ного раствора додеканового спирта в ацетоне (внутренний стандарт). Пробу вводят в испаритель хроматографа. Общее время анализа 45 60 мин. Время газохроматографического анализа 15-20 миН. Расчет процентного содержания гомосерина в анализируемом образе ведут по формуле г- m де С- процентное содержание гомосе- рина в. анализируемом образце; YO - содержание гомосерина по Kami6ровочному графику, мг/мл; Vvl - навеска синтетического гомосери- на, мг; 4 - содержание аммиака и воды в смоле, мл; 25 - общий объем после разведения; 1ООпроценты. 3 97 Пример расчета: С - 5ООО 100; С 7.95%. . Примеры 2, 3 и результаты определения гомосерина в модепьных растворах, синтетическом гомосерине, полученном химическим методом, приведены в табл.1 Пример 4. Определение гомосерина в модельных растворах, содержащих химически чистый гомосерин в биопогиче ких объектах. Методика выделения гомосерина из биологических объектов аналогична описанной в примере 1. 1 мл аммиачного раствора гомосерина вносят в колбочку с притертой пробкой для упаривания. К сухому остаГтку до ,бавпяютО,4 мл 50%-ного раствора трифторуксусного ангидрида в ацетоне. Реак

Примечание. Ошибка опродспеиня предлагаемого метоаа не препышает 3,3%.

Модельный водный раствор, содержащий 5 г/п химически чистогр гомосерина

Гомосвриновая купыурапькав жидкость, полученная с помощью микроорганизмов

Образец (по п, 2) с добавкой 5 г химически чистого гомосерина на 1 п образца

Т а б R н п « цию ацетилирования проводят в течение 3 мин при . Остаток реагентов удаляют холодным воздухом в течение 0,51 мин. К остатку добавляют 1 мп 0,1%ного раствора дибутипфталата в ацетоне (внутренний стандарт). Расчет ведут аналогично примеру 1. Примеры и результаты определения гомосерина в модепьных растворах приведены в табп. 2. Использование предлагаемого способа определения гомосерина методом газожидкостной хроматографии по предложенной методике повышает в 1,5-2 раза точность определения и сокращает время проведения анализа до 45 мин, т.е. в 68 раз. Табпика 1

Примечание, Ошибка определення не превышает 3,1% (относительных). ормупа изобретения Способ определения гомосерина, включающий гааожидкостную хроматографию летучих производных гомосерина, о т п и ч аю щ и и с я тем, что, с цепью повышения точности способа и сокращения времени анализа, анализируемую пробу обрабатывают трифторуксусным ангидридом в ацетоне при 15-ЗОС и в случае опредепения синтетического гомосерина

Г слолжряяс гаЛл. .2 дополнительно обрабатывают диазомета- ном с последующей газожидкостной хроматографией образующихся петучих проИЗВОДШ1ХИсточники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М., Мир, 1965, с, 393. 2.Берчфипд Г., Сторрс Ж. Газовая хроматография в биохимии. М., Мир, 1964, с. 534-536 (прототип).