Способ получения циклических пептидов Советский патент 1981 года по МПК C07K14/585 A61K38/23 A61K38/12 

Изобретение относится к способам получения циклических пептидов с зам кнутым дисульфидным мостиком, облада щих биологической активностью, которые могут найти применение в медицин Известен способ замыкания дисульфидного кольца в пептиде, содержащем два цистеиновых остатка, окислением соответствующего нециклического пептида 1 . Основной недостаток известного способа состоит в том, что для его осуществления необходимо использование окислительных агентов, что может привести к загрязнению пептида продуктами его окислительной деструкции и снижению .выхода целевого продукта. Кроме того, при окислении дисульфида кроме нужного циклического мономера образуются параллельные и антйпараллельные димеры, циклические или линейные высшие полимеры. В результате выход основного продукта снижается до 35%. Цель изобретения - повышение выхо да и упрощение процесса получения циклических пептидов. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения циклических пептидов путем замыкания дисульфидного мостика в нециклическом пептиде, содержащем не менее двух цистеиновых остатков, применяют исходный нециклический пептид, один из цистеиновых остатков которого содержит свободную сульфгидрильную функцию, а второй - сульфгидрильную функцию, защищенную н-алкилтио группой, и вьщерживают его в водном растворе, свободном от кислорода при рН от 5 до 10, в токе инертного газа. Причем используют.водно-спиртовый раствор, в качестве инертного газа применяют азот, и процесс проводят при рН 7,5 Нециклические пептиды, содержащие два цистеиновых аминокислотных остатка, которые являются промежуточными, имеют до отщепления защитных групп структуру 5R BZ 1 I (A)j,, а после кислотно обработки, проведенной для отщепления защитных групп, струн туру SR (А), где А - аминокислотный остаток; X - ноль или целое число/ Cys - цистеиновый остаток/

R - н-алкилтио-группа;

Вг - бензильная группа или ее

производное.

Пептид имеет один цистеиновый остаок со свободной сульфгидридьнойфункией, второй цистеиновый остаток за- с ищен н-алкилтио-групцой. Такие пепиды выдерживают в растворе, лучше одном или спиртовом, при рН от 5 до 0 до тех пор, пока не пройдет самороизвольная перегруппировка до соот- JQ етствующего циклического дисульфидного пептида с вытеснением, н-алкилмеркаптана.

Пример 1. Синтез окситоцина. Активация смолы. 5 г бензгидриламиновой смолы (ВНА) 5 с титром амина 0,43 мэкв/г помещают в реактор и обрабатывают следующими растворителями, используя каждый раз 20 мл порции и фильтруя после каждой обработки: метиленхлорид - 2 мин, 20 хлороформ - два раз а по 2 ,мин, 10 %-ный Триэтиламин в хлороформе - два раза по 5 мин, хлороформ - 2 мин, метиленхлорид - три раза по 2 мин.

9. Сочетание. 25 Перемешивают в течение 10 мин смолу ВНА, 20 мл метиленхлорида и 0,75 г

(0,0043 моль) ВОС-глицина. Затем в реактор загружают 4,3 мл раствора дициклогексилкарбодиимида в метилен- ч хлориде (1 мэкв дициклогексилкарбодиимида на 1 мл раствора). Смесь перемешивают б ч. Смолу ВОС-глицин-ВНА отфильтровывают и подвергают следующим последовательным 2 минутным про- мывкам, каждый раз фильтруя; метиленхлорид - (20мл X 2), метиловый спирт (20 мл X 2), метиленхлорид - (20 мл х X 2).

Ацетилирование. К 40 смоле добавляют со смесью 1,6 мл ук- сусного ангидрида, 2,4 мл триэтйламина и 20 мл хлороформа и перемешивают в течение 30 мин. Реакционную смесь фильтруют и смолу подвергают еле-it дующим промывкам, продолжая каждую в течение 2 мин, хлороформ(20 мл X 2), метиловый спирт - (20млх X 2), метиленхлорид.- (20 мЛ х 3). Нингйдриновая проба отрицательна. ел

. Снятие защиты. Смолу, защищенную ВОС, перемешивают 5 -мин со смесью 12 мл трифторуксусной кислоты и 12 мл метиленхлорида. Фильтруют, и смолу перемешивают со второй смесью 12 мл трифторуксусной кислоты и 12 мл метиленхлорида в течение 30 мин. Смесь фильтруют, и смолу промывают следующими растворителями, беря по 20 мл:, метиленхлорида -2 ра-40 за по 2 мин, метиловый спирт - 2 раза по 2 мин, хлороформ - 2 раза по 2 мин, 10%-ный триэтаноламин в хлороформе 2 раза rio 5 и 10 мин, метиленхлорид 2 раза по 2 мин. 5

Для смолы BHA-L-глицин титр амина или глицина,.составляе 0,384 мэкв амина или глицина на 1 г смолы.

Цикл 8. Сочетай и, е. L-Глициновую смолу, 20 мл метиленХлорида и 2,95 г (0,0038 моль) BOC-L-лейцина перемешивают в воде в течение J.O мин. Затем в реактор добавляют 3,8 МП раствора дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (1 мзкв дициклогексилкарбодиимида (DCC1) на 1 мл раствора или всего 0,0038 моль DCC1). Смесь перемешивают 2 ч, затем реак.ционную смесь удаляют из реактора и смолу подвергают следующим последовательным 2-минутным промывко1м., каждый раз фильтруя: метиленхлорид (20 мл X 2), метиловый спирт -(20мл X 2), метиленхлорид - (20 мл х 2). Нингйдриновая проба отрицательна.

.Снятие защиты, в этом цикле Повторяют .методику снятия защитных групп, как вцикле 9.

Цикл 7. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 8, но вместо лейцинового производного используют 0,82 г (О.,0038 моль) BOC-L-npoлина.

Цикл 6. Сочетание и снятие защитных групп проводят в условиях цикла 8. Ацетилирование, как в цикле 9. Для сочетания применяют 1,07 г (0,0038 моль) ВОС-5-этилтио-1-цистеин

Цикл. 5. Сочетание. Пептидную смолу из цикла б дважды промывают, беря по 20 мл диметипформамида. Затем смолу перемешивают 24 ч с раствором 2,02 г (0,0057 моль) ВОС-L-аспарагин-п-нитрофенилового эфира в 25 мл диметилформамида. Реакционную смесь фильтруют и пептидную смолу подвергают последовательным двухминутным промывкам по 20 мл следунлцими расворителями: диметилформамид, метиленхлорид, метанол, метиленхлорид. Промывки отделяют фильтрованием. Нингидриновая проба отрицательна.

Удаление защиты. Методика снятия защитных групп, как в цикле 8.

Цикл 4. Сочетание проводят в условиях, описанных в цикле 5. Ацетилирование - как в цикле 9. Снятие защитных групп - как в цикле 8. Применяют следующее аминокислотное производное: 2,09 г (0,0057 моль) п-нитрофенилового- эфира BOC-L-глутамина.

Цикл 3. Сочетание проводят в условиях, описанных в цикле 8. Сочетание повторяют, применяя смесь 10 мл диметилформамида и 10 мл метиленхлорида, и такое же количество аминокислоты и дициклогексилкарбодиимида. Ацетилирование ведут, как в цикле 9. Снятие защитных групп, - как в цикле 8 Для реакции сочетания применяют О, 88 г (0,0038 моль) BOC-L-изолейцина.

Цикл 2. Сочетание. Пептидную смолу из цикла 3 промывают двумя последовательными- порциями по 20 мл диметилформамида. Затем пепти ную смолу перемешивают 10 мин со смесью 2,11 г (0,0057 моль) ВОС-о-бензил-1-тирозина и 20 мл диметилформамида. Затем добавляют 5,7 мл д циклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,0057 моль ОСС1), и смесь перемешива рт 16 ч, з тем фильтруют. Пептидную смолу подвергают 2-минутнь1м промывкам по 20 м каждая следующими растворителями по 2 раза: диметилформамид, метиленхло рид, метанол и метилеихлорид. Сочетание повторяют, применяя по ловину указанного количества аминокислотных производных и дициклогёксилкарбодиимида в метиленхлориде при перемешивании в течение 6 ч. Ацетилирование. Ведут, как в примере 9. Снятие защитных групп. Ведут как в примере 9. Цикл 1. Сочетание ведут, как в цикле 8. Сочетание повторяют, применяя половину указанного количества аминокислотного производного и дидиклогексилкарбодиимида в метиле хлориде. Снятие защитных групп ведут как в цикле 9. В первой реакции сочётания применяют 1,3 г (0,038 моль) вое-S-метоксибензил-L-цистеина. По окончании цикла 1 пептидную смолу последовательно промывают двумя порциями по 20 мл н-гексана. Пептидное вещество извлекают из реактора и сушат в электровакуумной печи при ,1 мм рт.ст. в течение 24 ч. Вес блокированной пептидной смолы окситоцина г. Отщепление ф т о р и стым водород Ом. 2г высушенной пептидной смолы и 2 мл анизол помещают в тефлоновый peaKTOpV снабженный магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием. Реактор охлаждают в бане с сухим льдом и ацетоном. В реактор конденсируют 15 мл газообразного фтористого водорода. Смесь пере мешивают при 0°С на ледяной бане в т чение 1 ч. Фтористый водород испаряю при пониженном давлении. Остаток растирают с 4-я 25 мл порциями этилацетата. Пептид экстрагируют со смолы 2x50 мл порциями ледяной уксусной кислоты. Экстракт лиофилизируют, пол чают 486 мг отщепленного пептида. Циклизация, пептид до окситоцина. 200 мгсырого пентида растворяют в 50 мл не содержащей кислорода дистиллиро-, ванной воды с добавкой 1 мл ледяной уксурной кислоты. рН раствора доводят до 7,5 добавлением концентрированной гидроокиси аммония. Смесь перемешивают в герметичном сосуде в токе азота 24 ч. К этому времени в выходящем азоте уже не содержится меркаптана. Содержание этилмеркаптан в выходящем азоте определяют, пропуская ток fasa через раствор реагента Эллмана. рН реакционной смеси доводят до 3,5 добавлением ледяной уксусной кислоты. Лиофилизируют и получают твердый остаток. Очистка сырого окситоцина. Твердый остаток растворяют в 0,5 н. уксусной кислоте и чистят, пропуская через колонку, заполненную Сефадексом G 25 (тонкий), и элюируют 0,5 н. уксусной кислотой. Окситоциновую фракцию из этой колонки собирают и лиофилизируют, получают 54 мл белого осадка. Осадок вновь растворяют в 0,5 н.уксусной кислоте и чистят гель-фильтрацией через Се-фадекс G-25 (тонкийJ, элюируют 0,5 н. уксусной кислотой. Окситоциновую фракцию собирают, лиофилизируют, получают пушистый белый оссщок. Анализ продукта показал следующие количества с1минокислот: Gly 1,0; Leu 0,98; Pro 0,97; Asp 0,89; Glu 0,84; lie 0,74, Tyr 0,72. Теоретическое количество должно составлять 1,0. Содержание Cys не определяют, так как эта кислота разрушается при анализе. Биологическая активность полученного продукта составляет 305,4 единицы на 1 мг. Этот способ может быть также применен к синтезу соматостатина. Пример 2. Синтез человеческого кальцит-онина. Активация смолы. 4г бензгидриламиновой смолы (ВНА) с аминовым титров 0,55 мэкв/г загружают в реактор и обрабатывают 20 мл следующих растворителей, фильтруя после каждой промывки. метиленхлорид 2 мин, хлороформ два раза по 2 мин, 10%-ный триэтил-амин в хлороформе два раза по 5 мин, хлороформ - 2 мин,, метиленхлорид три раза по 2 мин. Цикл 32. Сочетание. Смолу ВНА,.20 мл метиленхлорида и 0,95 г (0,0044 моль) BOC-L-пролина Перемешивают 10 -мин. В реактор добавляют 4,4 мл метиленхлоридного раствора дициклогексилкарбодиимида (1 мэкв ОСС1 на 1 мл раствора) и смесь перемешивают 6 ч. Реакционную смесь отфильтровывают, и смолу BOC-L-пролил-ВНА ,подвергают последовательным промывкам, продолжительностью 2 мин по 20 мл растворителя, каждый раз фильтруя: метиленхлорид - 2 раза,., метиловый спирт - 2 раза, метиленхлорид - 2 раза. Ацетили, рование. Смолу перемешивают со смесью 1,5 мл триэтиламина, 1 мл уксусного ангид- рида и 20 мл хлороформа в течение 2 ч. Реакционную смесь отфильтровывают, и смолу промывают последовательно по 2 мин по 20 мл следующими растворителями. хлороформ - 2 раза. метиловый спирт - 2 раза-и метиленхлорид - 3 раза. Нингидриновая проба отрицательна. Снятие защитных групп. Защищенную ВОС смолу пере мешивают 5 мин со смесью 12,5 мл тр фторуксусной кислоты и 12,5 мл мети ленхлорида. Смесь фильтруют, и смолу перемешивают со второй смесью, состо щей из 12,5 мл трифторуксусной кисло и 12,5 мл метиленхлорида в течение ,30 мин. Реакционную смесь фильтруют и смолу подвергают последовательным промывкам по 20 мл: метиленхлоридом 2 раза по 2 мин , метиловым спиртом 2 раза по 2 мин, хлороформом 2 раза по 2 мин, 10%-ным триэтиламином в хлороформе 2 раза по 10мин, хлороформом 2 раза по 2 мин, метиленхлор дом 2 раза по 2 мин. Смолу L-пролин-ВНЛ титруют для .установления титра амина или пролин Эта величина составляет 0,494 мэкв амина или пролина на 1 г смолы, Ц и к л 31. Сочетание. L-пролильную смолу, 20 мл метиленхлорида и 0,83 г (0,0044 моль) ВОСаланина перемешивают 10 мин. Затем в реактор добавляют 4,4 мл раствора дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (1 мэкв DCC1 на 1 мл раствора или всего 0,0044 моль DCC)), и смесь перемешивают 2 ч. Реакционную смесь отфильтровывают и получен ную ВОС-1-аланил-1-пролил-ВНА, смолу подвергают последовательным 3-минут ным промывкам по 20 мл, каждый раз фильтруя: метиленхлоридом 2 раза, метиловыгл спиртом 2 раза, метиленхлоридом 3 раза. Нингидриновая проб отрицательна. Циклы 30-26. Сочетание и сня тие защиты ведут, как в цикле 3.1, но вместо аланиноБОго производного применяют следующие аминокислотные производные: цикл 30 - 0,77 г (0,0044 моль) ВОС-глицина, цикл 29 0,95 г (0,0044 моль) BOC-L-валина, цикл 28 - то же вещество, что в цикле 30, цикл 27 - 1,02 г (0,0044 мол BOC-L-изолейцина, цикл 26 - то же вещество, что в цикле .31. Цикл 25, Сочетание. Пептидную смолу из цикла 26 дважды промывают 20 мл порциями диметилформ амида. Затем ее перемешивают 10 мин со смесью 2,04 г (0,0066 моль) ВОС-р -бензил-1-треонина и 20 мл диметилформамида. Добавляют 6,6 мл дицикло гексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,0066 моль DCC1), и смесь перемешивают 6 ч. Реакционную емесь фильтруют. Пептидную смолу подвергают 2 минутным промывкам пор циями по 20 мл в следунлдих растворителях: диметилформамид, метиленхло.рид, метиловый спирт, метилен слорид Нингидринов ая проба отрицательна. Снятие защиты. Ведут как в цикле 32. Цикл 24. С очетание. Лептидную смолу из цикла 25 дважды промывают 20 мл-порциями диметилформамида. Затем смолу перемешивают 24 ч с раствором 2,42 г (0,0066 моль) п-нитрофенилового эфира ВОС-L-глутамина в 25 мл диметилформамиде, Реакционную смесь фильтруют и пептидную смолу подвергают 2-минутным промывкам двумя последовательными порциями по 20 мл каждая в следующих растворителях: диметилформамид, метиленхлорид, метанол, метиленхлорил. Каждый растворитель отфильтровывают. Нингидриновая проба отрицательна. Снятие защиты. Ведут, как в цикле 32. Цикл 23. Сочетание. Пептидную смолу из цикла 24 перемешивают. 10 мин с 1,42 г (0,0066 моль) BOC-L-пролина и 20 мл метиленхлорида„ Добавляют 6,6 мл раствора дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,0066 моль DCCI), и смесь перемешивают 16 ч. Реак.ционную смесь отфильтровывают, и пептидную смолу подвергают последовательным промывкам по 20 мл каждая, продолжительностью 2 мин следующими растворителями: метиленхлорид, метиловый спирт, метиленхлорид. Каждую промывку фильтруют, Нингидриновая проба отрицательна. Снятие защиты. Ведут как в цикле 32. Цикл 22. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 23, но при сочетании вместо BOC-L-пролина применяют 1,75 г (0,0066 моль) BOC-L-фенилаланина. Циклы с 21 по 18. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо аланинового производного применяют следующие аминокислотные производные: цикл 21 1,36 г (0,0044 моль) ВОС-о-бензил-L-треонина цикл 20 - 1,71 г (0,0044 моль) BOC-N-(jт)-карбобензилокси-1-гистидина, цикл 19 1,17 г (0,0044 мол) BOC-L-фенилаланина, цикл 18 - 1,67 г (0,0044 моль) ВОС- -карбобензилокси-1-лизина. . . Цикл 17. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 24, но вместо глутаминового производного применяют 2,33 г (0,0066 моль) п-нифтофенилового эфира BOC-L-аспарагина. Ц и к л ы 16 и 15.Сочетание и сняие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо аланилового производного приеняют следующие аминокислотные -произодные: цикл 16 - Г,17 г (0,0044 моль) ОС-и-фенилаланина, цикл 15 - 1,42 г (0,0044 моль) -бензилового эфира OC-L-аспартовой кислоты. Цикл 14. ёедут так же, как цикл 24. Цикл 13. Ведут так же, как цикл 21. Цикл 12. Сочетание и сняти защиты проводят в условиях, описан в цикле 15, но вместо треонинового производного берут 2,45 г (0,0066 мо ВОС-о-бензил-1-тирозина, и перемеш вают смесь 16 ч. Ц и к л 11. Ведут так же, как цикл 25. Ц и к л ы 10-7. Сочетание и сня тие защит ведут, как в цикле 31, но в реакции сочетания вместо BOC-L-ал нина берут следующие аминокислотные производные: цикл 10 - 0,77 г (0,0044 моль) ВОС-глицина, цикл 9 1,02 г (0,0044 моль) БОС-L-лейцина цикл 8 - 1,1 г (0,0044 моль) BOC-L -метионина, цикл 7 - 1,24 г (0,0044 моль) ВОС-5-этилтио-1-цисте ина.. Цикл 6. Ведут так же, как цикл 25. Циклы 5 и 4. Сочетание и сн тие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо BOC-L-аланина применяют следующие аминокислотные производны цикл 5 - 1,3 г (0,0044 моль) ВОС-о-бе зил-1-серина, цикл 4 - 1,02 г (0,0044 моль) BOC-L-лейцина. Цикл 3. Условия проведения те же, что и в цикле 17. Циклы 2и1. Сочетание и сн тие защит ведут как в цикле 31, но вместо BOC-L-аланина применяют следующие аминокислотные производные: цикл 2 - 0,77 г (0,0044 моль) ВОС-глицина, цикл 1 - 1,5 г ,JO,0044 мол ВОС-5-п-метоксибензил-1-цистеина. По окончании цикла 1 пентидную смолу два раза промывают 20 мл порц ями н-гексана. Пептидное вещество выгружают из реактора и сушат в электровакуумной печи при 40с и 0,11 мм рт.ст. в течение 24 ч. Вес блокированной пептидной смолы человеческого кальцитонина - 11 г. Отщепление фторис тым водородом. 2г высу шенной пептидной с)1олы и 2 мл анизо помещают в теплоновый реактор, снаб женный магнитной мешалкой с тефлоно вым покрытием, и охлаждаемый в бане с ацетоном и сухим льдом. В ре актор конденсируют 15 мл газообразного фтористого водорода. Смесь перемешивают при на ледяной бане в течение 1 ч. Фтористый водород отгоняют при пониженном давлении. Остаток растирают с 4x25 м этилацетата. Пептид экстрагируют из смолы 2x50 мл ледяной уксусной кислоты. Экстракты лиофилизируют и получают 1063 мг отщепленного пептида. Циклизация пептида до человеческ го кальцитонина. 1000 мг сырого пе тида растворяют в 250 мл не содержащей кислорода дистиллированной воды с 1 мл ледяной уксусной кислоты, рН раствора доводят до 7,5 добавлением концентрированной гидроокиси аммония. Смесь перемешивают в герметичном сосуде в токе азота в течение 24 ч. К этому времени в выходящем азоте уже не содержится этилмеркаптан. Содержание этилмеркаптана в выходящем азоте определяют пропусканием азота через раствор реактива Эллмана. рН реакционной смеси доводят до 3,2 добавлением ледяной уксусной кислоты. После лиофилизации получают твердый продут весом 985 мг. Очистка сырого человеческого кальцитонина. Твердый продукт растворяют в 0,5 н.уксусной кислоте и чистят гель-хроматографией на Сефадекс G-25 (тонкий), элюируют 0,5 н. уксусной кислотой, фракцию человеческого кальцитонина из этой колонки собирают и лиофилизируют, получают белый пушистый осадок, который растворяют в 0,05 М водном ацетате аммония (). рН раствора доводят до 5 и раствор чистят ионнообменной хроматографией на колонне SR-Сефадекс G-25. Продукт элюируют буфером - ацетатом аммония. Фракцию, содержащую человеческий кальцитонин, дважды лиофилизируют, получают пушистый белый осадок. Установлено, что это вещество биологически и химически эквивалентно продукту, описанному в литературе. Аминокислотный анализ (кислотный гидролиз) дает следующие количества аминокислот (теоретические величины даны в скобках): Lys 1,02 (1); His 0,99 Asp 3,28 (3); Thz 5,21 (5); Gly 4,33 (4) ; 1,95 (2) 0,74 (1) ; Glu (1); Met Ala 2,03 (2) ; Val 1,04 0,86 (1); Me 1,07 (1); Leu 2,24 (2); tyr 0,7 (1); Phe 3,0 (3). Величины для Pro и Cys не определяют. Биологическая активность составляет 100 MRC единиц на 1 мг. Этот способ может быть применен в синтезе вазопрессина, сйинного кальцитонина, бычьего кальцитонина. Пример 3. Синтез кальцитонина лосося. Активация смолы. 5г смолы ВНА с титром по амину 0,61 мэкв/г помещают в реактор и обрабатывают растворителями, каждый раз беря по 25 мл соответствующего растворителя и фильтруя реакционную массу после каждой обработки: метиленхлорид 2 мин, хлороформ - 2 мин по два раза, 10%-ный триэтиламин в хлороформе 5 мин по два раза, хлороформ - 2 мин, метиленхлорид - г мин по три раза. Цикл 32. Сочетание. Смолу ВНА 25 мл ,метиленхлорида и 1,29 г (0,006 моль) BOC-L-пролина . перемешивают 10 мин, добавляют 6,0мл раствора дициклогексилкарбодиимида (1 мэкв DCC1 на 1 мл раствора) в метиленхлориде, и смесь перемешивают 6 ч. Смолу ВОС-пролин-ВНА дтфильтро вывают и подвергают следующим последовательным 2-минутным промывкам: метиленхлоридом (2x25 мл), метиловым спиртом (2x25 мл) и вновь метиленхлоридом (3x25 мл). После каждой промывки смолу фильтруют. Ацетилирование. К смоле добавляют смесь 1,5 мл триаэти амина, 1 МП уксусного ангидрида и 25 мл хлороформа и перемешивают в те чение 2 ч, затем фильтруют и смолу промывают следующими растворителями: хлороформом (2x25 мл), -метиловый спирт (2x25 мл), метиленхлорид (3x25 мл). Каждая промывка длится 2 мин.. Удаление защитных групп. Смолу, защищённую ВОС, перемешивают 5 мин в смеси 15 мл трифторуксусной кислоты и 15 мл метиленхлорида, фильтруют, вновь перемешивают с этой же смесью растворителей в течение 30 мин. Фильтруют и смолу промывают растворителями, беря их по 25 мл: метиленхлоридом (2x25 мл), метиловым спиртом (2x25 мл хлороформом (2x25 мл). Каждая промывка продолжается 2 мин, 10%-ным триэтиламином в хлороформе (2x25 мл) 10 мин, хлороформом и метиленхлоридом (2x25 мл). Две последние промывки также продолжаются 2 мин. Для смолы L-пролин-ВНА устанавливают тит амина или пролина. Эта величина равна 0,55 мэкв амина или пролина на 1 г смолы. Цикл 31. С о ч е т а н и е. Смесь, содержащую смолу L-пролина, 25 мл метиленхлорида и 1,7 г (0,0055 моль) ВОС-о-бензил-1-треонин перемешивают 10 мин. Затем в раство до.бавляют 5,5 мл раствора дициклогексилкарбодиимида (1 мэкв DCC1 на 1 мл раствора или всего 0,0055 моль DCC1) в метиленхлориде, и смесь пере мешивают в течение 2 ч. Реакционную смесь фильтруют, и смолу подвергают следуюцщм последовательным 2-минутны промывкам: метиленхлорид (2x25 мл), метиловый спирт (2x25 мл), метилен.хлорид (3x25 мл). Нингидриновая реак ция отрицательна. Снятие защитн ы х г .р у п п. Проводят в условиях, опи санных для цикла 32. . Циклы 30-27. Применяют методику сочетания и удаления защитных групп,, .как в цикле 31, но вместо тре ониНового производства используют следующие аминокислотные производные цикл 30 - 0,97 г (0,0055 моль) ВОС-глицина; цикл 29 - 1,62 г (0,0055 моль) ВОС-о-бензил-1-серина цикл 28 - то же соединение,что и в цикле 30; цикл 27 - то же соединени что и в цикле 31. Цикл 26. Сочета,ние. Пептидную смолу из цикла 27 промыва иметилформамидом (3x25 мл). Затем смолу перемешивают 24 ч с раствором 2,9 г (0,008 моль), п-нитрофенилового эфира BOC-L-аспарагина в 35 мл димеилформамида. Реакционную смесь фильтуют и пептидную смолу подвергают 2-минутным промывкам последовательно ледующими растворителями: диметилормамид, метиленхлорид, метанол, етиленхлоркд, каждый раз беря по 25 мл. Растворитель отделяют фильтрованием. Нингидриновая проба отрицательна. Удаление защитных групп. Проводят в условиях, описанных для цикла 32. Цикл 25. Сочетание и удаление защитных групп осуществляют в условиях, описанных для цикла 31, применяя те же вещества в таких же количествах. Ц и к л 24.. Сочетание. Пептидную смолу из цикла 25 промыв,а1бт двумя последовательными порциями по 25 мл диметилформамида и перемешивают 10 мин со смесью 3,43 г (0,08 моль) BOC-N-y-L-аргинина в 25 мл диметилформамида. Затем добавляют 8 мл дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,008 моль DCC1), смесь перемешивают 6 ч, фильтруют. Пептидную смолу подвергают двухминутным промывкам следугацими растворителями-: диметилформамид (2x25 мл), метиленхлорид (2x25 мл), метиловый спирт (2x25 мл), метиленхлорид (2x25 мл). Нингидриновая проба отрицательна. Удаление защитных групп. Проводят в условиях,описанных для цикла 32. Цикл 23. Сочетание. Пептидную смолу, полученную в цикле 24., перемешивают 10 мин с 1,77 г (0,008 моль) BOC-L-пролина и 25 мл метиленхлорида . Добавляют 8 мл дициклогёксилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,008 моль DCCl смесь перемешивают б ч, фильтруют и пептидную смолу подвергают двухминутным промывкам следующими растворителями: метиленхлорид (2x25 мл), метиловый спирт (2x25 мл), метиленхлорид (2x25 мл). После каждой промывки смолу отфильтровывают. Нингидриновая реакция отрицательна. Удаление защитных групп. Проводят в условиях, описанных в цикле 32. Циклы 22 и 21. Условия, в которых проводят сочетание и удаление защитных групп, описаны в цикле 24, но в реакции сочетания вместо ВОС-L-пролина применяют следующие аминокислотные производные: цикл 22 2,97 г (0,008 моль) ВОС-о-бензил-L-тирозина, цикл 21 - 2-47 г (Of008 моль) ВОС-о-бензил-1-треонина..

Цикл 20. Методика та же, что описана в цикле 26, но вместо аспарагинового производного применяют 3,0 г (0,008 моль) п-нитрофенилового эфира вое-L-глутамина.

Циклы 19-15, Методика та же, что описана в цикле 31, но вместо треониновых производных берут следующие аминокислотные производные: кл 19 - 1,37 г (0,0055 моль) ВОС-L-лейцина, цикл 18 -.2,09 г (0,0055 мол|) BOC-L-карбобензилокси-1-лизина/ цикл 17 - 2,58 г (0,0055 мол BOC-N-(iт)-карбобензилокси-1-гистидина; цикл 16 - как в цикле 19/ цикл 15 - 1,85 г (0,0055 моль) у-бензилового эфира BOC-L-глутаминовой кислоты.

Цикл 14. Условия реакции описаны в цикле 20.

Цикл 13. Методика такая же, как в цикле 23, но вместо пролоновых производных берут в реакцию сочетани 2,36 г (0,008 моль) ВОС-о-бензил-L-серина.

Циклы 12-9. Методика такая же, как в цикле 31, но в реакцию сочетания вместо треонинового производного берут следующие а.минокислотные производные: цикл 12 - то же вещество, что в цикле 19; цикл 11 то же вещество, что в цикле 13; цикл 10 - то же вещество, что и в цикле 30} цикл 9 - то же вещество, 41 о и в цикле 19.

Цикл 8. Сочетание. Пептидную смолу, полученную в цикле 9, перемешивают 10 мин с 1,79 г (0,008 моль) BOC-L-валина и 25 мл метиленхлорида. Затем добавляют 8 мл дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,008 моль DCC1), и смесь перемешивают 16 ч. Пептидную смолу отфильтровывают и подвергают 2-минутнрй промывке следующими растворителями; метиленхлорид (2x25 мл), метиловый спирт (2x25 мл), метиленхлорид (2x25 мл). После каждой промывки смолу отделяют фильтрованием.

Удаление защитных групп. Проводят, как описано в цикле 32.

Цикл 7. Методика из цикла 31, но при сочетании вместо треонинового производного применяют 1,55 г (0,0055 моль) ВОС-5-этилтио-1-цистеина.

Цикл 6. Вещества и методика описаны в цикле 31.

Цикл 5. Вещества и методика описаны в цикле 29..

Цикл 4. Вещества и методика описаны в цикле 19.

Цикл 3. Вещества и методика описаны в цикле 26. ;

Цикл 2. Вещества и методика описаны в цикле 29.

Ц и к л 1. Методика описана в цикле 31, но вместо треонинового производного применяют. 1,88 г (0,0055 моль ВОС-5-п-метоксибензил-1-цистеина.

По окончании цикла 1 пептидную смолу промывают,н-гексаном (2x25 мл)отфильтровывают и сушат в электрической вакуумной печи при и давлении 0,1 мм рт.ст. в течение 24 ч.

Расщ.епление фтористым водородом. 16 г смеси сухой пептидной смолы и 16 мл анизола помещают в реактор из тефлона, снабженный покрытой тефлоном магнитной мешалкой. :Реактор.- охлаждают в бане из сухого льда и ацетона и конденсируют в нем 100 мл фтористого водорода. Эту смесь перемешивают при на ледяной бане в течение 1 ч. Фтористый водород упаривают при пониженном давлении. Остаток растирают в этилацетате (6x100 мл). Пептид экстрагируют 800 мл О,1 М водного раствора уксусной кислоты.

Циклизация пептида в лососевый кальцитонин. Водно-уксуснокислый экстракт пептида, полученного после отщепления смолы фтором водорода, разбавляют до 1,5 л 700 мл дистиллированной воды, рН раствора доводят до 7,5 добавлением концентрированной гидроокиси аммония. Раствор перемешивают в герметичном сосуде в токе азота в течение 24 ч. За это время весь отщепившийся этилмеркаптан уходит С током азота. Содержимое этилмекаптана в токе азота определяют с помощьючреагента Эллмана, рН реакционной смеси доводят до 5,0 ледяной уксусной кислотой.

Очистка сырого лососевого кальцитонина. 1,5 л -полученного раствора с рН 5,0.концентрируют с помощью ионнообменной колонки SD-Сефадекс 0-25. Получают 75 мл концентрата в 0,5 М растворе хлористого натрия, его обессоливают, чистят гель-фильтрацией через Сефадекс G-25 (мелкий), элюируют 0,03 М водной уксусной кислотой. Фракцию лососевого кальцитонина из этой колонки доводят до рН 6,0 раствором гидроокиси аммония. Раствор чистят ионнообменной хроматографией на колонке, заполненной Ватман СМ 52. Для элюирования используют аммонийацетатный буфер. рН фракции лососевого кальцитонина из колонки доводят яо 5,О ледяной уксусной кислотой. Раствор концентрируют на ионнообменной колонке с Сефадексом G-25. 30 мл концентрата, выведенного из колонки 0,5 М раствором хлористого натрия, обессоливают гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G-25 (тонкий). Очищенную фракцию лососевого кальцитонина сушат вымораживанием. Продукт получают в виде пушистого белого твердого вещества.

Аминокислотный анализ (кислотный гидролиз) дает следующие количества аминокислот (теоретические величины даны в скобках): Arg 1,05 (1); Asp 1,84 (2); Glu 3,14 (3 ) ; G 1 у . 3 ,06 (3 ) 5 His 0,94 (1); Leu 5,01 (5); Lys 1,94 (2);Pro 2,11 (2); Ser 3,86(4); Thr 5,15 (5); Tyr 0,85 (1); Val 0,95 (1).

Содержание Cys не определяют.

Пример 4. Методику из примера 3 повторяют, применяя те же вещества, в таких же количествах при всех райных условиях, насколько это практически возможно, но в цикле 24 ВОС-М-тозил-1-тирозин заменяют 2,5 г (0,008 моль) ВОС-М-нитр9-1-ар.гинина. Полученные результаты идентичны тем, что описаны в примере 3.

Пример 5. Повторяют методику примера 3, применяя те же вещества, в. тех же количествах и при тех же условиях,но в цикле 22 вместо ВОС-о-бензил-С тирозина берут 3,45 г (0,008 моль) В.ОС-о-2-бромбензилоксикарбонил-1-тирозина. Результаты аналогичны полученным в примере 3.

Пример 6. Все методики, вещества и условия применяют как в -примере 4,но и в циклах 18. и 11 Вбс- -бензилоксикарбонил-1-лйзин заменяют 2,28 г 0,0055 моль ВОС-е.-2-хлорбензил-оксикарбонил-и- лизином. Получают

результаты, совпадакяцие с описанными

в примере 3,.

Формула изобретения

1.Способ псЗЯученияциклических пептидов путем замыкания дисульфидного мостика в нециклическом пептиде, содержащем не менее двух цистеиновых остатков, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и упрощения процесса, применяют исходный нециклический пептид, один из цистеиновых остатков которого содержит свободную сульфгидрильную функцию, а второй - сульфгидрильную функцию, защищенную н-алкклтио-группой, и ввдерживают его, в водном растворе, свободном от кислорода при рН от 5 до 10, в токе инертного Газа. .

2.Способ ПОП.1, отличающ и и fc я тем,что применяют водноспиртовый раствор.

3.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве инертного газа применяют азот.

4. Способ ПОП.1, Отличающийся тем, что процесс проводят при рН 7,5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Шредер Э., Любке К. Пептиды,

М. , Мир, 1967, с. 350.