Штамм СоRYNевастеRIUм аммоNIаGеNеS - продуцент инозин-5 @ -монофосфата Советский патент 1993 года по МПК C12P19/32 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается микробиологического синтеза инозин-5 - монофосфата (5,-ИМФ).

51-ИМФ находит широкое применение в пищевой промышленности как высокоактивная вкусовая приправа.

Целью изобретения является увеличение уровня накопления 5,-ИМФ и повышение эффективности использования глюкозы.

Это достигается получением нового штамма Corynebacterium (Вrev bacterium) ammoblagenes AS72-26. депонированного

во Всесоюзной; коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В- 5534.

Штамм В-5534 получен генетико-селек- ЦиОнным путем без применения мутагенной обработки с использованием ступенчатого отбора мутантов, резистентных к повышающимся концентрациям арсената. Исходным материалом для селекции послужил пигмен- тообразующйй штамм Br.ammonlagenes 79-5 (ВКПМ В-3279), накапливающий смесь четырех продуктов пуринового и пиримиди- нового происхождения - уридин-5 -моно- фосфата (УМФ), урацила 5 -ИМФ и

ю

ы

гипоксантина. Штамм В-5534 отличается от родительского штамма В-3279 устойчивостью к арсенату, улучшенным ростом на жидких и твердых средах, утратой способности к образованию пигмента при росте на агаризованной среде Хоттингера. В отличие от родительского штамма, он накапливает исключительно 5,-ИМФ,

Культурно-морфологические признаки,

Грамположйтельная палочка длиной до 1,5 мкм, шириной 0,6-0,8 мкм, без жгутиков, неподвижная, не образует спор. На агаризованной среде Хотингера после 1-2 суток культивирования при 30-34° образует колонии круглой формы диаметром 2,0-3,0 мм с ровным краем бледно-желтого цвета. Поверхность колоний гладкая, с матовым блеском и слабой концентрической исчер- ченностью. При посеве петлей на твердую среду Хоттингера после инкубации в течение 24 ч при 30-34° наблюдается умеренный рост, поверхность штриха гладкая, блестящая, бледно-желтого цвета. В отличие от родительского штамма, заявляемый штамм В-5534 утратил способность к выделению в среду красно-бурого пигмента при инкубации на полноценной агаризованной среде Хоттингера.

Аэроб. При посеве уколом в полноценный агар растет только на его поверхности. При инкубации на жидких полноценных средах при 30-34° без встряхивания рост отсутствует, пленки на поверхности не образуется. При встряхивании,через 24 ч наблюдается значительное помутнение.

Для роста на жидкой и агаризованной средах требуется добавка аденина, биотина, витаминов Вт иВз.

Культуру поддерживают на косяках с агаризованной средой Хоттингера с добавкой аденина в концентрации 10 мг на 1 л среды.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм В-5534 является ауксотрофом по аденину. Желатину не разжижает, на крахмальном агаре и обезжиренном молоке роста нет. На ломтиках картофеля рост умеренный, клетчатку не разрушает и не усваивает. Нитраты не восстанавливает. Усваивает глюкозу, фруктозу, рибозу, цитрат, пуриновые и пиримидиновые рибонуклео- зиды, плохо усваивает сахарозу, сорбит, маннит, не. потребляет лактозу, галактозу, фумарат, сукцинат, ксилозу, арабинозу, глицерин, рамнозу, маннозу.

Антагонистических свойств не обнаруживает. Не патогенен.

Устойчив к арсенату в концентрации 2 мМ. В результате резистентности к арсенату штамм В-5534 полностью потерял способность к накоплению пигмента и образованию

пиримидиновых производных (УМФ и ура- цила).

Как следует из данных, приведенных в таблице, при культивировании штамма В- 5534 он образует до 32,2-35,0 г/л 5Ч/1МФ, в то время как штамм-прототип накапливает 26,8 г/л 5 -ИМФ. При этом скорость накопления 5,-ИМФ и степень конверсии глюкозы у заявляемого штамма значительно превы- шает соответствующие показатели штамма- прототипа.

П р и м е р 1. Культуру Corynebacterium (Brevlbacterlum) ammonlagenes В-5534 со скошенного агара Хоттингера переносят в 5 жидкую посевную среду следующего состава, мас.%:

глюкоза техническая 2,0 пептон1,0 дрожжевой экстракт 1,0 0 NaCI 0,25

водадо 100 Посевной материал выращивают в колбах емкостью 750 мл, содержащих 75 мл среды, на качалке, делающей 240-250 об/мин 5 при 34° в течение 24 ч. Посевной материал в количестве 10 об.% переносят в ферментационную среду следующего состава, %: глюкоза техническая 15,0 кукурузный экстракт 6,0 0 КН2Р04 3,0 MgS04 7Н20 1,0 мочевина 0,84 вода до 100 Среду стерилизуют при 0,8 атм в тече- 5 ние 30 мин, мочевину стерилизуют отдельно в-оиде 40%-ного раствора при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды подводят ,3 раствором КОН JN и добавляют раствор мочевины.

0 Процесс ферментации осуществляют в колбах емкостью 750 мл, содержащих 30 мл среды, на качалке, делающей 350 об/мин, что соответствует скорости растворения кислорода 3,8 г 02/л ч при 34°. После 144 ч 5 ферментации в культуральной жидкости накапливается 32,2 г/л 5 -ИМФ. Степень конверсии глюкозы 21,5% (в прототипе 17,8%). П р и м е р 2. Штамм, условия выращивания посевного материала и условия фер- 0 ментации те же, что в примере 1. Отличия заключаются в составе ферментационной среды, мас.%:

глюкоза техническая 14,0 кукурузный экстракт 8,0 5 КН2Р043,0 MgSO r7H20 1,0 мочевина 0,84 вода до 100 После 144 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается 35,0 г/л 5 -ИМФ.

Степень конверсии глюкозы 25,0% (в прототипе 17,8%)

Таким образом, заявляемый штамм Corynebacterlum (В re vl bacterium) ammonlagenes ВКПМ В-5534 обладает следующими преимуществами по сравнению со штаммом-прототипом:

превосходит штамм-прототип по количеству накапливаемого целевого продукта 5Ч/1МФ на 20-30%;

обладает большей скоростью накопления 5 -ИМФ;

отличается более высокой эффективностью использования глюкозы на единицу продукции.

Формула изобретения Штамм Corynebacterlum ammonlagenes ВКПМ В-5534 - продуцент инозин-5 -моно- фосфата.

Использование: биотехнология, микробиологическая промышленность и касается микробиологического синтеза инозин-5-монофосфата. Сущность изобретения: штамм Corynebacterium (Brevlbacterlum) ammonlagenes ВКПМ В-5534 получен гене- тико-селекционным путем без применения мутагенной обработки с использованием ступенчатого отбора мутантов, резистентных к повышающимся концентрациям арсената из родительского штамма Br. ammonlagenes 79-5 (ВКПМ В-3279). В отличие от родительского штамма В-3279, накапливающего смесь четырех продуктов пурмнового и пиримиди- нового происхождения - уридин-5-моно- фосфата, урацила, инозин-5-монофосфата и гипоксантина. штамм В-5534 является продуцентом исключительно инозин-5-монофос- фата. Штамм В-5534 обладает наиболее высокой активностью накопления инозин-5- монофосфата (до 35,0 г/л) среди эффективных из патентной литературы штаммов. Кроме того, он более эффективно использует глюкозу на образование целевого продукта. 1 табл.

Сравнение основных показателей, характеризующих заявляемый штамм

и штамм-прототип