ШТАММ CORYNEBACTERIUM AMMONIAGENES - ПРОДУЦЕНТ 5'-КСАНТИЛОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5'-КСАНТИЛОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C12P19/40 C12R1/15 

Область техники

Изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему 5'-ксантиловую кислоту.

Конкретнее, изобретение относится к селекции с целью повышения ростовой активности мутантного штамма Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340, способного быстро проходить фазу задержки роста ранней культуры и накапливать 5'-ксантиловую кислоту в культуральной среде за тот же период ферментации с высоким выходом и высокой степенью обогащения.

Известный уровень техники

5'-Ксантиловая кислота представляет собой промежуточный продукт процесса биосинтеза нуклеиновых кислот, который является физиологически важным в организме животных и растений и находит применение в продуктах питания, изделиях медицинского назначения и различных других областях техники. Изобретение относится к мутантному штамму, полученному из известного штамма Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340, продуцирующему 5'-ксантиловую кислоту методом прямой ферментации с более высоким показателем выхода и степенью обогащения, чем в известном способе.

5'-Ксантиловая кислота является промежуточным продуктом процесса биосинтеза пуринового нуклеотида и важным материалом для производства 5'-гуаниловой кислоты. Широко используемым методом производства 5'-гуаниловой кислоты высокого качества и с высокой степенью обогащения является метод бактериальной ферментации, в котором сначала продуцируют 5'-ксантиловую кислоту, а затем ферментативно превращают ее в 5'-гуаниловую кислоту; таким образом, для получения 5'-гуаниловой кислоты необходимо соответствующее количество 5'-ксантиловой кислоты. Обычными методами получения 5'-ксантиловой кислоты являются хемосинтез, дезаминирование 5'-гуаниловой кислоты, продуцируемой в результате разложения рибонуклеиновой кислоты дрожжей, ферментативный метод с добавлением ксантина в качестве материала прекурсора в среду ферментации, ферментативный метод с использованием мутантного штамма микроорганизма, метод с добавлением антибиотического материала (JP 1477/42 и JP 20390/44), метод с добавлением поверхностно-активного вещества (JP 3825/42 и JP 3838/42) и т.д. Весьма предпочтительным из перечисленных методов для промышленного производства является метод прямой ферментации 5'-ксантиловой кислоты мутантным штаммом микроорганизма. Авторы настоящего изобретения получили мутантный штамм с повышенной продуктивностью по 5'-ксантиловой кислоте путем модифицирования известных характеристик Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 с введением признака продуцирования 5'-ксантиловой кислоты с высоким выходом.

Большинство микроорганизмов при культивировании в постоянных условиях достигают состояния, в котором при продолжении культивирования их объем более не возрастает, в частности, прекращается увеличение концентрации микроорганизмов, продуцирующих первичный метаболит, являющийся ростзависимым продуктом. Основной причиной этого является ограниченное снабжение растворенным кислородом. Для решения проблемы ограниченного снабжения растворенным кислородом используется метод усиления аэрации и перемешивания, но в условиях реального производства существуют технические и экономические ограничения. Авторы настоящего изобретения предположили, что создание нового микроорганизма с повышенными ростовыми характеристиками при прочих равных условиях будет полезным для преодоления этих ограничений и увеличения выхода и концентрации 5'-ксантиловой кислоты за счет увеличения объема микроорганизмов и различных видов физиологической активности в условиях ограниченного снабжения растворенным кислородом. Таким образом, авторы настоящего изобретения провели исследования и обнаружили, что мутантный штамм, способный быстро проходить фазу задержки роста при ранней культивации и обладающий улучшенными характеристиками роста, является наиболее эффективным и может продуцировать 5'-ксантиловую кислоту с более высоким выходом и степенью обогащения, чем в известном способе, и осуществили этот подход в настоящем изобретении.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к Corynebacterium ammoniagenes CJXSP 0201 (KCCN-10448), представляющему собой мутантный штамм Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340, продуцирующий 5'-ксантиловую кислоту.

CJXSP 0201 получают методом спонтанной мутации с использованием Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 в качестве родительского штамма и селекцией мутантного штамма. Метод спонтанной мутации заключается в следующем: 5 мл питательной среды (глюкоза 20 г/л, пептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 10 г/л, хлорид натрия 2.5 г/л, мочевина 3 г/л, аденин 150 мг/л, гуанин 150 мг/л, pH 7,2) наливают в пробирку диаметром 18 мм и стерилизуют под давлением по обычной методике. Затем высевают в нее Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 и культивируют при встряхивании со скоростью 200 об/мин, 30°С, в течение 18 часов, и полученный материал используют в качестве посевной культуры. Высевают 50 мкл посевной культуры в стерилизованную колбу Эрленмейера для встряхивания на 500 мл и добавляют 40 мл минимальной среды (глюкоза 20 г/л, дигидроортофосфат калия 1 г/л, гидроортофосфат калия 1 г/л, мочевина 2 г/л, сульфат аммония 3 г/л, сульфат магния 1 г/л, хлорид кальция 100 мг/л, сульфат железа (II) 20 мг/л, сульфат марганца 10 мг/л, сульфат цинка 10 мг/л, биотин 30 мкг/л, тиамина гидрохлорид 0,1 мг/л, сульфат меди 0,8 мг/л, аденин 20 мг/л, гуанин 20 мг/л, pH 7,2). Затем ее культивируют при встряхивании со скоростью 200 об/мин, 30°С, в течение 24 часов и после достижения ранней логарифмической фазы роста высевают 50 мкл культуры в другую колбу Эрленмейера для встряхивания на 500 мл, в которую добавляют 40 мл минимальной среды. После достижения ранней логарифмической фазы роста (оптическая плотность 0,5 (λ=562 нм)) снова высевают 50 мкл культуры в другую колбу Эрленмейера для встряхивания на 500 мл, в которую снова добавляют минимальную среду. Такой процесс, называемый пассированием (субкультивированием), повторяют 20 раз. Конечную культру высеивают штрихами на чашку Петри с минимальной средой, содержащей 1,5% агара, и культивируют в инкубаторе при 30°С до образования колоний. Из колоний выбирают те, которые проявляют относительно быстрый рост в качестве мутантных штаммов с улучшенными характеристиками. Из них был выделен штамм, обладающий повышенной продуктивностью по 5'-ксантиловой кислоте и скоростью роста, который был назван CJXSP 0201 и депонирован в соответствии с Будапештским соглашением в Корейском центре культур микроорганизмов 21 ноября 2002 г. с номером доступа KCCM 10448. Время образования колоний для известного штамма KCCM 10340 составляет 38 часов, а для штамма CJXSP 0201 по изобретению - 31 час, т.е. CJXSP является мутантным штаммом с улучшенными характеристиками роста.

Наилучший способ осуществления изобретения

Пример 1

Используемые штаммы: Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340, Corynebacterium ammoniagenes CJXSP 0201.

Посевная среда: глюкоза 30 г/л, пептон 15 г/л, дрожжевой экстракт 15 г/л, хлорид натрия 2,5 г/л, мочевина 3 г/л, аденин 150 мг/л, гуанин 150 мг/л, pH 7,2.

Среда для ферментации: (1) среда А: глюкоза 60 г/л, сульфат магния 10 г/л, сульфат железа (II) 20 мг/л, сульфат цинка 10 мг/л, сульфат марганца 10 мг/л, аденин 30 мг/л, гуанин 30 мг/л, биотин 100 мкг/л, сульфат меди 1 мг/л, тиамина гидрохлорид 5 мг/л, хлорид кальция 10 мг/л, pH 7,2;

(2) среда Б: дигидроортофосфат калия 10 г/л, гидроортофосфат калия 10 г/л, мочевина 7 г/л, сульфат аммония 5 г/л.

Метод ферментации: 5 мл посевной среды наливают в пробирку диаметром 18 мм и стерилизуют под давлением по обычной методике. После стерилизации засевают, соответственно, Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 и Corynebacterium ammoniagenes CJXOL 0201 и культивируют при встряхивании со скоростью 180 об/мин, 30°С, в течение 18 часов. Полученный материал используют как посевную культуру. Затем используемые в качестве сред для ферментации среду А и среду Б раздельно стерилизуют под давлением по обычной методике и 29 мл среды А и 10 мл среды Б, соответственно, наливают в стерилизованную колбу Эрленмейера для встряхивания на 500 мл, засевают 1 мл указанной выше посевной культуры и ферментируют при 200 об/мин, 30°С, в течение 90 часов. После завершения ферментации, определение количества накопленной в среде 5'-ксантиловой кислоты показало, что для KCCM 10340 оно составляет 23,0 г/л, а для CJXSP 0201 - 24,7 г/л (концентрация накопленной 5'-ксантиловой кислоты в переводе на 5'-ксантат натрия·7Н₂O).

Пример 2

Используемые штаммы: те же, что и в Примере 1.

Первичная посевная среда: та же, что и посевная среда в Примере 1.

Вторичная посевная среда: глюкоза 60 г/л, дигидроортофосфат калия 2 г/л, гидроортофосфат калия 2 г/л, сульфат магния 1 г/л, сульфат железа(II) 22 мг/л, сульфат цинка 15 мг/л, сульфат марганца 10 мг/л, сульфат меди 1 мг/л, хлорид кальция 100 мг/л, биотин 150 мкг/л, аденин 150 мг/л, гуанин 150 мг/л, тиамина гидрохлорид 5 мг/л, пеногаситель 0,6 мл/л, pH 7,2

Среда для ферментации: глюкоза 151 г/л, фосфорная кислота 32 г/л, гидроксид калия 25 г/л, аденин 198 мг/л, гуанин 119 мг/л, сульфат железа (II) 60 мг/л, сульфат цинка 42 мг/л, сульфат марганца 15 мг/л, сульфат меди 2,4 мг/л, аланиат (alaniate) 22 мг/л, NCA 7,5 мг/л, биотин 0,4 мг/л, сульфат магния 15 г/л, цистинат (cystinate) 30 мг/л, гистидинат (histidinate) 30 мг/л, хлорид кальция 149 мг/л, тиамина гидрохлорид 15 мг/л, пеногаситель 0,7 мл/л, CSL 27 мл/л, экстракт тунца 6 г/л, pH 7,3.

Первичная посевная культура: 50 мл первичной посевной среды наливают в колбу Эрленмейера для встряхивания на 500 мл и стерилизуют под давлением при 121°С в течение 20 минут. После охлаждения высевают, соответственно, Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 и Corynebacterium ammoniagenes CJXOL 0201 и культивируют при встряхивании со скоростью 180 об/мин, 30°С, в течение 24 часов.

Вторичная посевная культура. Вторичную посевную среду наливают в 5-литровые экспериментальные ферментационные ванны (по 2 л в каждую) и стерилизуют под давлением при 121°С в течение 10 минут. После охлаждения высевают 50 мл указанной выше первичной посевной культуры и культивируют при расходе воздуха 0,5 vvm, при 900 об/мин, 31°С, в течение 24 часов. В процессе культивации поддерживают pH среды на уровне 7,3 с помощью аммиачной воды.

Метод ферментации. Среду для ферментации наливают в 30-литровые экспериментальные ферментационные ванны (по 8 л в каждую) и стерилизуют под давлением при 121°С в течение 20 минут. После охлаждения засевают указанной выше вторичной посевной культурой (по 1,5 л в каждую) и культивируют при расходе воздуха 1 vvm, при 400 об/мин, 33°С. Если в процессе культивации уровень остаточного сахара опускается ниже 1%, подают стерилизованную глюкозу и поддерживают уровень общего сахара в среде для ферментации 30%. В процессе культивации поддерживают уровень pH среды 7,3 с помощью аммиачной воды, и продолжительность процесса составляет 90 часов. После завершения ферментации определение количества накопленной в среде 5'-ксантиловой кислотой показало, что для KCCM 10340 оно составляет 137,2 г/л, а для CJXSP 0201 - 146,8 г/л (концентрация накопленной 5'-ксантиловой кислоты в переводе на 5'-ксантат натрия·7Н₂О).

Промышленная применимость

Изобретение предусматривает использование Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 в качестве родительского штамма и воздействие на него УФ-излучением, мутагенными производными, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG), по обычной методике. Штамм KCCM 10340 устойчив к осмотическому давлению, создаваемому высокой концентрацией 5'-ксантиловой кислоты, накапливающейся в процессе культивации, высокой концентрацией глюкозы и различных источников углерода, добавленных в культуральную среду, что приводит к высокому осмотическому давлению вне бактериальных организмов, ингибированию нормальной физиологической активности клеток-продуцентов 5'-ксантиловой кислоты и уменьшению продуцирования 5'-ксантиловой кислоты. Для получения штамма, обладающего повышенной ростовой активностью при прочих равных условиях, изобретение предусматривает модифицирование Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 и селекцию мутантного штамма, способного быстро проходить фазу задержки роста в ранней культуре и позволяющего накапливать 5'-ксантиловую кислоту в культуральной среде с высоким выходом и высокой степенью обогащения за тот же период ферментации.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу продуцирования 5'-ксантиловой кислоты с помощью культивирования мутантного штамма Corynebacterium ammoniagenes CJXSP 0201, депонированного под номером КССМ 10448 и обладающего резистентностью к олигомицину. Для получения штамма Corynebacterium ammoniagenes CJXSP 0201 используют Corynebacterium ammoniagenes КССМ 10340 в качестве родительского штамма, воздействуя на него УФ-излучением и мутагенными производными, например N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (NTG), по обычным методикам. Таким образом, настоящее изобретение позволяет накапливать 5'-ксантиловую кислоту в культуральной среде с высоким выходом и высокой степенью обогащения. 2 н.п. ф-лы.

1. Corynebacterium ammoniagenes CJXSP 0201, депонированный под номером КССМ 10448, обладающий резистентностью к олигомицину и продуцирующий 5'-ксантиловую кислоту.2. Способ продуцирования 5'-ксантиловой кислоты, включающий культивирование штамма по п.1.