ШТАММ CORYNEBACTERIUM AMMONIAGENES - ПРОДУЦЕНТ 5'-КСАНТИЛОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5'-КСАНТИЛОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/21 C12P19/40 C12R1/15 

Область техники

Данное изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему 5′-ксантиловую кислоту.

Конкретнее, изобретение касается мутантного штамма Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340, обладающего резистентностью к олигомицину, который ингибирует активность АТФ-синтазы и процесс окислительного фосфорилирования, с целью усиления респираторной активности, что позволяет повысить АТФ-репредуцирующую активность за тот же период ферментации и накапливать 5′-ксантиловую кислоту в культуральной среде с высоким выходом и высокой степенью обогащения.

Известный уровень техники

5′-Ксантиловая кислота представляет собой промежуточный продукт процесса биосинтеза нуклеиновых кислот, который является физиологически важным в организме животных и растений и используется в пищевых продуктах, изделиях медицинского назначения и разных других областях. Изобретение относится к мутантному штамму, обладающему резистентностью к олигомицину, полученному из известного штамма Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340, продуцирующему 5′-ксантиловую кислоту с высоким выходом и высокой степенью обогащения методом прямой ферментации.

5′-Ксантиловая кислота является промежуточным продуктом процесса биосинтеза пуринового нуклеотида и важным материалом для производства 5′-гуаниловой кислоты. Широко используемым методом продуцирования 5′-гуаниловой кислоты, имеющей высокие показатели качества и чистоты, является метод ферментации микроорганизмом, который сначала продуцирует 5′-ксантиловую кислоту, а затем ферментативно превращает ее в 5′-гуаниловую кислоту; таким образом, для получения 5′-гуаниловой кислоты необходимо соответствующее количество 5′-ксантиловой кислоты. Обычными методами получения 5′-ксантиловой кислоты являются хемосинтез, дезаминирование 5′-гуаниловой кислоты, образующейся в результате разложения рибонуклеиновой кислоты дрожжей, ферментативный метод с добавлением ксантина в качестве материала прекурсора в среду ферментации, ферментативный метод с использованием мутантного штамма микроорганизма, метод с добавлением материала, обладающего антибиотическим действием (JP 1477/42 и JP 20390/44), метод с добавлением поверхностно-активного вещества (JP 3825/42 и JP 3838/42) и т.д. Из перечисленных методов, значительными преимуществами с точки зрения промышленного применения обладает метод прямой ферментации 5′-ксантиловой кислоты мутантным штаммом микроорганизма. Таким образом, авторы настоящего изобретения создали мутантный штамм с повышенной продуктивностью по 5′-ксантиловой кислоте путем модифицирования известных характеристик Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 с введением признака продуцирования 5′-ксантиловой кислоты с большим выходом.

Большинство микроорганизмов при культивировании в постоянных условиях достигают состояния, в котором при продолжении культивирования их объем более не возрастает, в частности, прекращается увеличение концентрации микроорганизмов, продуцирующих первичный метаболит, являющийся рост-зависимым продуктом. Основной причиной этого является ограниченное снабжение растворенным кислородом. Для решения проблемы ограниченного снабжения растворенным кислородом используется метод усиления аэрации и перемешивания, но в условиях реального производства такой подход имеет технические и экономические ограничения. Авторы настоящего изобретения предположили, что повышение респираторной активности и АТФ-репродуцирующей активности микроорганизмов при постоянной концентрации растворенного кислорода будет полезным для преодоления ограничений и повышения выхода и концентрации 5′-ксантиловой кислоты путем увеличения объема микроорганизмов и различных видов физиологической активности при ограниченном снабжении растворенным кислородом. Таким образом, авторы настоящего изобретения исследовали штаммы микроорганизмов, обладающие резистентностью к различным респираторным ингибиторам, обнаружили, что мутантный штамм, обладающий резистентностью к олигомицину, является наиболее эффективным из них и может продуцировать 5′-ксантиловую кислоту с высоким выходом и высокой степенью обогащения методом прямой ферментации, и осуществили этот подход в настоящем изобретении.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к Corynebacterium ammoniagenes CJXOL 0201 (КССМ-10447), представляющим собой мутантный штамм Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340, продуцирующий 5′-ксантиловую кислоту. CJXOL 0201 получают путем воздействия на Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 УФ-излучением и мутагенными производными, такими как N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) по обычной процедуре, и селекции мутантного штамма из обладающих способностью к росту в культуральной среде (глюкоза 20 г/л, дигидроортофосфат калия 1 г/л, гидроортофосфат калия 1 г/л, мочевина 2 г/л, сульфат аммония 3 г/л, сульфат магния 1 г/л, хлорид кальция 100 мг/л, сульфат железа(II) 20 мг/л, сульфат марганца 10 мг/л, сульфат цинка 10 мг/л, биотин 30 мкг/л, тиамина гидрохлорид 0,1 мг/л, сульфат меди 0,8 мг/л, аденин 20 мг/л, гуанин 20 мг/л, рН 7,2) с разными концентрациями добавленного олигомицина (1, 2, 5, 10, 20, 50 мг/л). В соответствии с этой процедурой при добавлении в среду 0-50 мг/л олигомицина наблюдалась резистентность при концентрации олигомицина до 20 мг/л, но при концентрациях выше 20 мг/л рост отсутствовал. Штамм, способный расти при 20 мг/л олигомицина, был выделен, назван CJXOL 0201 и депонирован в соответствии с Будапештским соглашением в Корейском центре культур микроорганизмов 21 ноября 2002 г. под номером доступа KCCM 10447.

Биомеханические характеристики нового мутантного штамма CJXOL 0201 в соответствии с изобретением приведены ниже в Таблице 1. Согласно Таблице 1 микроорганизм по изобретению может расти в среде с добавкой 10 мг/л олигомицина. Среду ферментировали при 30°С в течение 5 дней.

Таблица 1ШтаммКонцентрация олигомицина (мг/л) 051020304050KCCM 10340++++++----CJXOL 0201+++++++++++--+: рост-: отсутствие роста

Предпочтительный способ осуществления изобретения

Пример 1

Используемые штаммы: Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340, Corynebacterium ammoniagenes CJXOL 0201.

Посевная среда: глюкоза 30 г/л, пептон 15 г/л, дрожжевой экстракт 15 г/л, хлорид натрия 2,5 г/л, мочевина 3 г/л, аденин 150 мг/л, гуанин 150 мг/л, рН 7,2.

Среда для ферментации:

(1) среда А: глюкоза 60 г/л, сульфат магния 10 г/л, сульфат железа (II) 20 мг/л, сульфат цинка 10 мг/л, сульфат марганца 10 мг/л, аденин 30 мг/л, гуанин 30 мг/л, биотин 100 мкг/л, сульфат меди 1 мг/л, тиамина гидрохлорид 5 мг/л, хлорид кальция 10 мг/л, рН 7,2;

(2) среда Б: дигидроортофосфат калия 10 г/л, гидроортофосфат калия 10 г/л, мочевина 7 г/л, сульфат аммония 5 г/л.

Метод ферментации: 5 мл посевной среды наливают в пробирку диаметром 18 мм и стерилизуют под давлением по обычной методике. После стерилизации высевают, соответственно, Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 и Corynebacterium ammoniagenes CJXOL 0201 и культивируют при встряхивании со скоростью 180 об/мин, 30°С, в течение 18 часов. Полученный материал используют как посевную культуру. Затем, в качестве среды для ферментации, среду А и среду Б стерилизуют раздельно под давлением по обычной методике и 29 мл среды А и 10 мл среды Б, соответственно, наливают в стерилизованную колбу Эрленмайера для встряхивания на 500 мл, засевают 1 мл вышеуказанной посевной культуры и ферментируют при 200 об/мин, 30°С, в течение 90 часов. После завершения ферментации определение количества накопленной в среде 5′-ксантиловой кислоты показало, что для KCCM 10340 оно составляет 23,0 г/л, а для CJXOL 0201 - 26,5 г/л. (Концентрация накопленной 5′-ксантиловой кислоты в переводе на 5′-ксантат натрия·7Н₂O).

Пример 2

Используемые штаммы: те же, что и в Примере 1.

Первичная посевная среда: та же, что и посевная среда Примера 1.

Вторичная посевная среда: глюкоза 60 г/л, дигидроортофосфат калия 2 г/л, гидроортофосфат калия 2 г/л, сульфат магния 1 г/л, сульфат железа (II) 22 мг/л, сульфат цинка 15 мг/л, сульфат марганца 10 мг/л, сульфат меди 1 мг/л, хлорид кальция 100 мг/л, биотин 150 мкг/л, аденин 150 мг/л, гуанин 150 мг/л, тиамина гидрохлорид 5 мг/л, пеногаситель 0,6 мл/л, рН 7,2.

Среда для ферментации: глюкоза 151 г/л, фосфорная кислота 32 г/л, гидроксид калия 25 г/л, аденин 198 мг/л, гуанин 119 мг/л, сульфат железа (II) 60 мг/л, сульфат цинка 42 мг/л, сульфат марганца 15 мг/л, сульфат меди 2.4 мг/л, аланиат (alaniate) 22 мг/л, NCA 7,5 мг/л, биотин 0,4 мг/л, сульфат магния 15 г/л, цистинат (cystinate) 30 мг/л, гистидинат (histidinate) 30 мг/л, хлорид кальция 149 мг/л, тиамина гидрохлорид 15 мг/л, пеногаситель 0,7 мл/л, CSL 27 мл/л, экстракт тунца 6 г/л, рН 7,3.

Первичная посевная культура: 50 мл первичной посевной среды наливают в колбу Эрленмейера для встряхивания на 500 мл и стерилизуют под давлением при 121°С в течение 20 минут. После охлаждения высеивают, соответственно, Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 и Coiynebactehum ammoniagenes CJXOL 0201 и культивируют при встряхивании со скоростью 180 об/мин, 30°С, в течение 24 часов.

Вторичная посевная культура: Вторичную посевную среду наливают в 5-литровые экспериментальные ферментационные ванны (по 2 л в каждую) и стерилизуют под давлением при 121°С в течение 10 минут. После охлаждения засевают 50 мл указанной выше первичной посевной культуры и культивируют при расходе воздуха 0,5 vvm, 900 об/мин, 31°С, в течение 24 часов. В процессе культивирования поддерживают уровень рН среды, равный 7,3, путем регулирования с использованием аммиачной воды.

Ферментативный метод: Наливают среду для ферментации в 30-литровые экспериментальные ферментационные ванны (по 8 л в каждую) и стерилизуют под давлением при 121°С в течение 20 минут. После охлаждения засевают указанной выше вторичной посевной культурой (по 1,5 л в каждую) и культивируют при расходе воздуха 1 vvm, 400 об/мин, 33°С. Если в процессе культивации уровень остаточного сахара опускается ниже 1%, то добавляют стерилизованную глюкозу и поддерживают общий уровень сахара в среде для ферментации 30%. В процессе культивации поддерживают уровень рН среды 7,3 путем регулирования с помощью аммиачной воды и проводят процесс в течение 90 часов. После завершения ферментации определение количества накопленной в среде 5′-ксантиловой кислоты показало, что для KCCM 10340 оно составляло 137,2 г/л, а для CJXOL 0201 - 148,4 г/л. (Концентрация накопленной 5′-ксантиловой кислоты в пересчете на 5′-ксантат натрия·7Н₂O).

Промышленная применимость

В настоящем изобретении Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 был использован в качестве родительского штамма и подвергнут воздействию УФ-излучения или мутагенных производных, таких как N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG), по обычной методике. Штамм KCCM 10340 устойчив к воздействию осмотического давления, создаваемого высокой концентрацией 5′-ксантиловой кислоты, накапливающейся в процессе культивации, высокой концентрацией глюкозы и различных источников углерода, добавляемых в культуральную среду, которые приводят к высокому осмотическому давлению вокруг бактериальных организмов, ингибированию нормальной физиологической активности клеток-продуцентов 5′-ксантиловой кислоты и снижению продуцирования 5′-ксантиловой кислоты. Для получения штамма, имеющего улучшенные характеристики устойчивости к осмотическому давлению и повышенную респираторную активность, изобретение предусматривает модификацию Corynebacterium ammoniagenes KCCM 10340 и селекцию мутантного штамма, обладающего резистентностью к олигомицину, который ингибирует активность АТФ-синтазы и процесс окислительного фосфорилирования, что позволяет повысить АТФ-репродуцирующую активность и накапливать 5′-ксантиловую кислоту в культуральной среде с высоким выходом и высокой степенью обогащения за тот же период ферментации.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу продуцирования 5'-ксантиловой кислоты с помощью культивирования мутантного штамма Corynebacterium ammoniagenes CJXOL 0201, депонированного под номером КССМ 10448 и обладающего резистентностью к олигомицину. Для получения штамма Corynebacterium ammoniagenes CJXOL 0201 используют Corynebacterium ammoniagenes КССМ 10340 в качестве родительского штамма, воздействуя на него УФ-излучением и мутагенными производными, например, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG), по обычным методикам. Таким образом, настоящее изобретение позволяет накапливать 5'-ксантиловую кислоту в культуральной среде с высоким выходом и высокой степенью обогащения. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Corynebacterium ammoniagenes CJXSP 0201, депонированный под номером КССМ 10447, обладающий резистентностью к олигомицину и продуцирующий 5'-ксантиловую кислоту.2. Способ продуцирования 5'-ксантиловой кислоты, включающий культивирование штамма по п.1.