Способ приготовления бумажной индикаторной полоски для определения дезаминаз бактерий Советский патент 1982 года по МПК C12Q1/00 G01N33/48 

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения феагента для определения дезаминаз у бактерий..

Известен способ приготовления индикаторных бумс1жных полосок для определения фенилаланиндезаминазы бактер 1й путем нанесения на хроматографическую бумагу фенилаланина и лимонноаммиачного железа (коричневого), растворенных в воде при , пропитывания хроматографической бумаги, высушивания ее при 50-бО°С, нанесения на нее 10%-ного водного раствора поливинилового спирта в виде пленки с последующим повторным высушиванием бумаги пои 50-60 С и оазоезанием ее на полоски шиоиною в 1 см. Фенилаланиндезаминазу определяют путем нанесения исследуемой бактериальной культуры в виде бляшки на поверхность индикаторной бумажки. Результаты реакции учитывают через 1015 мин. Срок годности бумажек 6 мес. При дальнейшем хранении имеет место изменение цвета индикаторных бумажных поло сок

К недостаткам известного способа следует отнести относительно сложный многоэтапный процесс приготовления индикаторных полосок, ограниченный срок годности, а также недостаточную экономичность, связанную с тем, что большая часть аминокислоты, импрегнированной в поры впитывающей бумаги, остается неиспользованной. Кроме того, импрегнированная реагентами хроматографическая бумага при высушивании коробится, полости бума10ги скручиваются. Дезаминазы опоеде. ляются непостоянно г. в положительных случаях реакция проявляется слабо и с большим опозданием шэи условии инкубации полосок во влаж-ной камере.

Целью изобретения является упрощение, ускорение способа и увеличение срЬка годности индикаторной полоски.

20

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготовления бумажной индикаторной полоски для определения дезаминаз бактерий, вклю- I чающему нанесение на поверхность бу мажного носителя аминокислоты, поливинилового спирта и железосодержаще.го реактива с последующим высушиванием, в качестве бумажног о носите - ля используют бумагу ватман, в ка честве железосодержащего реактива СРеЗОд-(NH JtSO -eHiOJ, т.е. соль Мо ра, указанные реактивы используют в виде водного раствора их смеси и нанесение их на носитель осуществ/1ЯЮТ в виде капель, а высушивание осуществляют при 18-25 С. При этом обычно при реализации способа для нанесения используют водный раствор аминокислоты tFeSt)4 X. (МНд) Я04.-6Н2Р и поливинилового спирта, содержащий данные компоненты соответственно в следующих количествах, г 1040,1, 5+0,1 и 10±0,1 на 1 л воды.. Применение соли Мора в предлагаемом способе для определения дезамина бактерий позволяет получить реагент который, не изменяет первоначаль ные свойст-ва в течение 3 лет (срок наблюдения) и следовательно, позволяет более достоверно судить о процессе дезаминирования.: Использование плотной, невпитывающей бум.аги (ватман) позволяет наносить реагирунлдие .субстраты в микро количествах на ограниченной площади в виде изолированных капель. Тем самым расширяется круг изучаемых ами нокислот,, создается достаточная их концентрация и в то же время снижает расход ингредиентов, поскольку исклю чается возможность пропитывания и диффузии реагентов в бумагу. этом создается возможность для более быстрого растворения и контакта субстрата с бактериями, нанесенными непосредственно на субстрат. Поливиниловый спирт фиксирует микроколичества ингредиентов к поверхности бумагиj связывает их между собой, ис ключает крошение высохших капель и предохраняет их от разрушения при длительном хранении. Согласно предлагаемому способу, где реагенты наносят на поверхность невпитываквдей бумаги ватман, имеет место их быстрое растворение: в воде содержащейся в микробной культуре, и соответственно быстрый контакт микробов с реагентами, что приводит к ускорению реакции дезаминирования (результаты учитываются через 2- 3 мин). По известному же способу учет результатов дезаминирования возможе только через 10-15 мин, так как хроматографическая бумага, впитываю щая воду., содержащуюся в бактериал ьной культуре, замедляет растворение реагентов. Кроме того, импрегнированные в поры бумаги реагенты медленно диффундируют через ее толщу и защитную пленку из поливинилового спирта и позднее приходят в контакт с бактериями. Высушивание капель проводят толь ко при комнатной температуре, так как при более высоких температурах растворы реагентов приобретают способность час-тично и неравномерно впитываться бумагой и их концентрация, в каплях становится неодинаковой и непостоянной, а капли расплываются на бумаге. При нанесении peat-eHTOB в виде маленьких точек на поверхность бу-. маги ватман и последующем взаимодействии их с микробной культурой имеет место полная утилизация аминокислоты, тогда как по известному способу основная час.ть аминокислоты остается неиспользованной бактериями. Способ осуществляют.следующим образом. Поливиниловый спирт растворяют совместно с аминокислотой в дистиллированной воде при .90-100 С, ох.лаждают при 15-25 С, добавляют и растворяют соль Мора. Полученный раствор наносят на .поверхность бумаги ватман, в виде капель объемом О ,0060,007 мл,которые высушивают при 18-25G. Для осуществления способа аминокислоту, поливиниловый спирт и соль Мора применяют в концентрациях соответственно 1$0,5 и 1%, . Носитель представляет собой пластинку из ПЛОТНОЙ невпитывающей .бумаги ватман прямоугольной формы размером 7,5x5,5 см, соответствующую параметрам чашки Петри. Поверхность носителя-расчерчена на 28 квадратов площадью 1 cMt В центр каждого квадрата наносят по капле получен ного реагента и пластинки оставляют при комнатной температуре до . полного их высыхания. Высохшие капли имеют све.тло-коричневый цвет. Готовые пластинки хранят при комнатной температуре в сухом ме:сте. На чертеже приведен образец получаемого по предлагаемому способу реагента. Схема образца реагента включает цифровые обозначения 1-14 изучаемых культур бактерий, бумажный носитель 15, квадрат 16, высушенные капли 17, содержащие реагент для определения дезаминаз у бактерий, реагент Ф, содержащий фенилаланин, реа:г9нт Т, содержащий триптофан. Пример. Из листа бумаги ватман вырезают ПРЯМОУГОЛЬНУЮ пластинку размером 7,5 х 5,5 см (15), расчерчивают на ее поверхности прямоугольник площадью 7,0x4,О см, разделяют его на 28 квадратов (16) площадью 1 см. Каждый горизонтальный ряд квадратов обозначают справа первоначальной буквой названий аминокислоты (Ф или Т), а над и под каждым вертикальным рядом квадратов обозначают номер изучаемой микробной культуры (1-.14) . В пробирку или колбу &ерут навес ку 100 мг порошка аминокислоты и 50 мг поливинилового спирта,-затем добавляют 10 мл дистиллированной во ды и растворяют ингредиенты над пла менем спиртовки или на водяной бане при ,90-100°С. Полученный раствор ох лаждают до комнатной температуры, п ле чего вносят 100 мг соли Мора рРеЗОд (МН4.)з ЗОд-бН О, которую ра оряют при легком встряхивании проб }СИ 15-25 С. Приготовленный раст що наносят nd одной капле Of(f)6-0,QQ7 МП с помощью пастеровск4: пипетки с/TOHko оттянутым капил роМ в центр каждого квадрата, соответствующего обозначению аминокислоты. Например, в квадраты горизонтального ряда Ф наносят капли, содержащие фенилгшанин, в квадраты горизонтального ряда Т - трипто-фан и т.д. После этого пластинки оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч до полного высыхания капель (17). Готовые пластинки хранят при ком натнэй температуре в сухом месте в картонных коробках или полиэтиленовых мешочках в течение 3 лет (срок наблюдения) (таблица). Результаты реакции дезаминирования аминокислот бактериями родов Proteus Providencia в зависимости от сроков хранения реагента представлены в таблице. По мере надобности пластинки используют для определения дезаминаз у бактерий. С этой целью пластинку помещают в чистую чашку Петри для исключения случайного заражения окружающих предметов. Затем полную бактериальную петлю изучаемой культуры, снятую со скошеного агара, наносят на поверхность высушенной капли с реагентом. При наличии соответствующей дезаминазы у микробов через 1-3 мин нанесенная культура и реагент окрашивают в цвет от темно-зеленого до черного. При отсутствии соответствующей дезаминазы культура и реагент не изменяют свою свою первоначальную окраску (светло-коричневый цвет) . Использованную часть пластинки отрезают, а оставшуюся часть сохраняют в той же чашке Петри для дгшьнейших . исследований. В приведенном примере реагенты, содержащие аминокислоты фенилаланин и триптофан, могут найти применение в дифференциации бактерий Кишечного семейства. В состав этого семейства входят бактерии группы P-roteus-Providencia, которые в отличие от остальных групп микробов данного семейства характеризуются . наличием фенилаланин- и триптофандезаминаз. В пределах одной системы в течение 1-3 мин может Оыть определено отношение к фенилаланину и триптофану 14 бактериальных культур., Технико-экономическая эффектив|ность изобретения состоит в упрощении и ускорении способа, увеличении срока годности получаемой индикаторной полоски, а также снижении расхода реактивов.. По известному способу 1 г с1минокислоты расходуется на проведение 2800 исследований, тогда как согласно предлагаемому 1 г аминокислоты достаточен для проведения более 15000 исследований,т.е. достигается экономический эффект белее,чем в 5,3 раза.

При м е чан и е. Интенсивность реакции: + - с/ абоположительная, ++ - положительная, +++ - резкоположительная.

Формула изобретения

раствора их смеси, наносят его на бумажный носитель. в виде капель. а высушивание осуществляют пои

le-as c.

2, Способ по п.1. о т л и ч а ющ и и с я тем, что. используют водный раствор аминокислоты, TFeSO/ х X .) 50461 О и поливинилового спирта, содержащий данные компоненты в следующих количествах соответственно, г: 10+0,1; 5±0,1 и 10+0,1 на 1 л воды.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Инфекционные заболевания у детей. Кишинев, Штиинца, 1978, с. 17-18.