Способ количественного определения гаптенов Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к иммунологии и может найти применение в медицине. Известен радиоиммунный способ определения гаптенов, согласно которому к,известному количеству антител добавляют известное количество меченого радиоактивной меткой (С,Н, , j) соответствующего ranteHa и неизвестное количество немеченого гаптена. Смесь инкубируют, затем выделяют из реакционной среды фракцию антител, связавших гаптены, и регистрируют радиоактивность этой выделенной фракции или оставшейся реакционной среды, по которой определяют неизвестное количество гаптена lj. Недостатками этого способа являются сложность и длительность процесса определения. Сложность обуслов лена необходимостью выполнения мертехники безопасности при работе с ра диоактивными препаратами, выполнения процедуры разделения антител и маточ ного раствора содержащего гаптены, а также.использованием дорогостоящего оборудования для регистрации радиоактивности и меченых радиоактивной меткой препаратов. В целом на процедуру определения затрачивается ч. Наиболее близким к предлагаемому является способ количественного определения гаптенов путем торможения гаптеном реакции антигена с антигаптеновым антителом, согласно которому используют конъюгирова нный на поверхности корпускулярной частицы эритроциты, частицы латекса или полимера антиген jj2J. Недостатками известного способа являются длительность процесса (15 20 ч), обусловленная низкой скоростью оседания эритроцитов после их смешивания с сывороткой, и сложность способа определения, обусловленная необходимостью приготовления конъюгированного антигена на поверхности корпускулярной частицы и некоторой субъективностью учета реакции из-за индивидуальных особенностей восприятия форма осадка. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа определения концен трации гаптенов. Цель достигается тем, что при осуществлении способа количественного определения гаптенов путем торможения гаптеном реакции антигена с антигаптеновым антителом, в качестве антигена используют конъюгироваиный свободный антиген белок-гаптен, все операции определения гаптенов проводят в ультразвуковом поле и количество гаптена определяют по изменению скорости ультразвука в реакцио ной среде, Все операции проводят в ультразву ковом поле. К раствор J-гл обулиновой фракции (1-10 мг/мл белка) гап теновой антисыворотки в физиологическом растворе, приготовленном на фосфатном буфере рН 7, добавляют известное количество гаптена, смесь перемешивают и инкубируют в течение 3 мин при . Затем к смеси добавляют раствор конъюгированного антигена гаптен-белок в конценУрации 5 10 -10 мг/мл. Раствор перемешивают, термостатируют в течение 1,5 мин и определяют скорость ультразвука в реакционной среде. Через 1-5 мин вновь регистрируют скорость ультразвука и рассчитывают разность этих скоростей. Операции повторяют при использовании разных концентраций гаптена от 10 до 10 моль/л и строят калибровочную кривую зависимости скорости ультразвука от концентрации добавленного гаптена. Для анализа неизвестной концентрации гаптена проводят все указанные операции, но вместо известной концентрации гаптена вносят в реакционную смесь анализируемую жидкость и рассчитывают изменение скорости ультразвука. По калибровочной кривой определяют количество гаптена в анализируемой жидкости. На фиг. 1 изображена калибровочная кривая зависимости изменения ско рости ультразвука в реакционной среде ,.-Щс (мм/с) от количества гаптена в области концентраций 5-10 -5 10 моль/л. На фиг. 2 изображена калибровочная кривая зависимости скорости ультразвука в реакционной среде ди (мм/с) от количества гаптена в области концентраций 51о-5-10 молЬ/л; П р и м ё р 1. Для .определенная концентрации фенобарбитала (ФБ) в интервале 510 5-10 оль/л в растворе используют антйфенобарбиталовую сыворотку, полученную по известному способу, из которой выделяют -глобулиновую фракцию, содержащую антитела к фенобарбиталу, с использованием сульфата аммония О -ного насыщения по известному способу. В качестве конъюгированного антигена используют конъюгат ФБ-яичный альбумин, полученный реакцией диазониевой соли аминофенобазобитала с яичным альбумином по известному способу. Затем строят калибровочную кривую для определения неизвестной концентраций гаптена в интервале концентрации 5-10- 510 моль/л ФБ-яичный альбумин в концентрации 8,0-10 мг/мл, приготовленный в физиологическом растворе с фосфатным 0, 01 М буфером рН 7, На этомже растворителе готовят растворыгаптена ФБ с концентрациями 5 X10 оль/л, М0 моль/л, Ч1(Гмоль/л; 510 оль/л, и-у глобулин с концентрацией 1 мг/мл белка. Далее к 10.0 мкл прогретого 25 С в акустическом резонаторе раствора3-глобулина добавляют 10 мкл раствора ФБ с концентрацией 5-10 моль/л, перемешивают и инкубируют 3 мин. Затем к этой смеси добавляют 10 мкл раствора конъюгата ФБ на яичном альбумине, перемешивают и спустя 1,5 мин регистрируют скорость ультразвука и.,, а на пятой минуте U . Разность полученных скоростей MJ заносят в таблицу. Далее перечисленные операции пбвтоярют Со всеми при готовленными концентрациями ФБ. Для контроля неспецифического взаимодействия р а ст вори т ел ь с глобул и ном (обоз н ачается как нулевая концентрация) операции повторяют с добавлением растворителя. Контролем на специфичность взаимодействия с ФБ служит раствор адреналина с концентрацией 5-10 Изменение скорости ультразвука при различных концентрациях фенобар- битала Г с использованием фиксированной концентрации конъю гата ФБяичный альбумин при показано в табл. 1.

т а 6 л и ц а 1

ли.

Концентрация ФВСг

мм/с моль/л

16,1+0,5

О

-7 $;6iQ,2

5-10 ,-6

,9+0,3

10

-6

2102,7+0,2

-6

3

10 1,5+0,3

-6

Ц

10 0,5+0,3

5

10 0,2+0,2

г 6 16,4+0, it

дреналин 10

По данным табл. 1 строят калибровочную зависимость изменения скорости ультразвука от величины концентрации гаптена (фиг. 1), Неизвестную концентрацию ФБ определяют, проводя торможение реакции конъюгированного антигена с антителом изложенным способом и используя калибровочную кривую.

П р и м е р 2. Для определения концентрации фенобарбитала в интервале моль/л используют те же вещества, что в примере 1.

Для этого используют раствор конъюгата ФБ-яичньт альбумин в концентрации 8,0-КГ мг/мл, приготовленный в физиологическом растворе с фосфатным 0,01 М буфером рН 7,4. На этом же растворителе подготовляют растворы гйптена ФБ с концентрацияк 1 5 , 2 , . 4 .10 -, 510 и д глобулина с концентрацией 1 мг/мл белка.

Далее к 100 мкп прогретого до в акустическом резонаторе раствора у-глобулина добавляют 10 мкл раствора ФБ с концентрацией 5 «10 моль/л, перемаиивают и инкубируют 3 мин. Затем к этой смеси добавляют 10 мкл раствора конъкзгата ФБ на яичном альбумине, перемешивают и спустя 1,5 мин регистрируют скорость ультразвука Цс, а затем на третьей минуте УЗ- Разность полученных скоростей ди заносят в таблицу. Далее перечисленные операции повторяют со всеми приготовлен60627«

ными концентрациями ФБ. Для контроля неспецифического взаимодействия растворителя Cv - глобулином (в таблице обозначается как нулевая концен$ трация) операции повторяют с добавлением растворителя. Контролем на специфичность взаимодействия у-глобулина с ФБ служит раствор адреналина с концентрацией 5010 моль/л. 10 Изменение скорости ультразвука различных концентрациях фенобарбатала ГгЗ с использованием фиксированной концентрации конъюгата ФБ яичный альбумин при .

Таблица2

По данным табл. 2 строят калибровочную кривую зависимости изменения скорости ультразвука от величины концентрации гаптена (фиг. 2).. Неизвестную концентрацию гаптена ФБ определяют, проводя торможение реакции конъюгированного антигена и антителом изложенным способом и используя калибровочную кривую.

Применение предлагаемого способа по сравнению с известнь1ми позволяет ускорить процесс проведения анализа в 60-80 раз, упростить процесс проведения анализа за счет исключения операций по получению одного из реагентов и повысить экономичность процесса за счет сокращения числа реагентов и времени процесса.

V

Формула изобретения

: Способ количественного опрёдёления гаптенов путем торможения ranтеном реакции антигена с антигаптеновым антителом, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, в качестве антигена используют конъюгированный свободный антиген белок-гаптен, вс.е операции определения гапте нов проводят в ультразвуковом поле и количество гаптена определяют по изменению скорости ультразвука в ре акционной среде. .78 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М., Мир, 1980, с. 257-267. 2. V.P.Butler, Jhe Immunological assay of Drugs, G. of Pharmaology and Experimental Therapeoties, vol. 29, Vf 2, 1978, p.p. 116-121.

ФМА