Штамм рSеUDомоNаS меNDосINа 3121 продуцент холестеролэстеразы Советский патент 1982 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к микpoби ологической промышленности, точнее к области получения ферментов путем микробиологического синтеза. Холестеролэстераза - фермент, рас цепляющий стероловые эфиры с образо ванием холестерина и высших жирных кислот, представляет интерес в связи с его действием на трудно гидролизуемые эфиры холестерина, накапливающиеся в значительных количествах в крови больных коронарным атероскле розом. Известны различные штаммы, продуцирующие холестеролэстеразу. Так известны штаммы бактерий Nocardla cholesterolicum NRRL 5767 и 5768 продуценты холестеролзстеразы при культивировании на питательной среде, содержащей индуктор и экстрактор дрожжей, обладающих невысокой активностью 1 J. На иболее бли з ки ми к предла г аемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являются штаммы Pseudomonas fluore cens НУ 3955 или Л032, 3975, 3081 и 31156. Специфическая удельная активность ферментов-сырцов составляет0,012ед/мг белка. Фермент не обладает узкой субстратной специфичностью: наряду со способностью гидролизовать эфиры холестерина, он обладает и липолитической активностью(. Недостатком известных штаммов является то, что синтез фермента бактериями происходит лишь при добавлении в питательную среду индукторов (сложных эфиров холестерина, жирных кислот или их эфиров и др. соединений). В отсутствии индукторов в среду выделяются лишь следы холестеро4Пдстеразы. Целью изобретения является выделение из бактерий рода Pseudomonas штамма-продуцента холестеролэстеразы, обладающего повышенной активностью. 39 Предлагаемый штамм 3121 относится к виду Pseudomonas mendoclna, по следний является новым источником выделения холестеролэстеразы. Штамм Р. mendocina 3121 выделен в отделе антибиотиков Института мик робиологии и вирусолог1 и АН Украинской ССР из активного ила в 1972 г. Биохимическое изучение биологически активных метаболитов Pseudomonas mendocina 3121 проводилось отделом антибиотиков Института микробиологии и вирусологии АН Украинской ССР совместно с отделами био химии ферментов и биохимии стеринов Института биохимии АН Украинской СС Штамм Pseudomonas mendocina 3121 храни9ся в коллекции Центрального Музея института ВНИИгенетика, кол лекционный номер ЦМПМ В-2173. Штамм Pseudomonas mendocina 3121 имеет следую1иие морфологические, ку туральные и физиологические характер стики. Морфология. Грамотрицательные па лочки подвижные, монотрихи. Включе ий поли-/ь-оксимасляной кислоты не образуют. Культуральные свойства. На мясопептонном агаре-колонии гладкие, круглые, блестящие, пастообразные, на мясо-пептонном бульоне - равноме ная муть. Бактерии не синтезируют желто-зеленый флюоресцирующий пигмент, характерный для многих видов бактерий рода Pseudomonas, образуют желтый внутриклеточный пигмент каротиноидной природы . Физиолого-биохимические свойства Строгие аэробы используют глюкозу только по окислительному пути. Оксидазоположительные по Ковачу. Оптимальная для роста температура 27 при +2°С растут. Анаэробно расщепля ют аргинин, не обладают левансахаразами, липазами и лецитиназами, активные денитрификаторы, крахмал, желатин, эскулин не гидролизуют, глоконат не окисляют, хинную кислоту не превра1Мают в протокатеховую,, чувствительны к нитрофурантоину. Источники азота. Усваивают аммиа ные и .нитратные формы азота. Источники углерода. В качестве единственного источника углерода штамм P.seudomonas mendocina 3121 ис пользует свыше 31) органических соединений разнообразного химического строения, в .том числе глюкозу, раз. . личные органические кислоты (капри-. ловую, малоновую, янтарную, фумаровую, глюта15овую, молочную, гликолевую, пировиноградную, лимонную, (i-кетоглютаровую, итаконовую, яблочную) ; полиспирты, гликоли и низшие спирты (маннит, слабо - этанол, пропанол и бутанол); из ароматических соединений - хинную кислоту, аминокислоты (глицин, oi- и/5-аланин, -ар- ( гинин, глютаминовую и -аминомасляную,кислоты, пропил); некоторые азотистые соединения (бетаин, саркозин), а также среднецепочечные Н-алканы с числом углеродных атомов от С Д° Не усваивают в качестве единственного источника углерода: ксилозу, сахарозу, арабинозу, маннозу, галактозу, трегалозу, мальтозу, целлобиозу, крахмал, салицин; кислоты: малеиновую, адипиновую, пимелиновую, винную М- и П- оксибензойную, гиппуровую, фенилуксусную, сорбит, инозит, фенол, лейцин, саркозин, ацетамид и фолиевую кислоту. Условия хранения культуры. Суточную культуру бактерий засевают уколом в высокий столбик 0,51 мясо-пептонного агара и после 8 ч роста при заливают 2-3 мл стерильного ва|зелинового масла. В этих условиях штамм-продуцент хранится без пересевов не менее k лет при комнатной температуре. /1ля повседневной работы бактерии высевают из исходной музейной культуры на скошенный мясопептонный агар, на котором у них сохраняется способность к дальнейшим пересевам в течение 10 дней. П р и м е р 1. Получение фермента Путем культивирования штамма продуцента на среде без индуктора. Определение его специфической акТ1ЙВНОСТИ. а) Культивирование штамма-продуцента. Культуру Pseudomonas mendocina 3121 выращивают на скошенном мясопептонном агаре, температура , смыв суточной культуры вносят в среду, разлитую по 100 мл в эрленмейеровские колбы объемом 0,75 л. Состав среды, г/л: . Глюкоза 20,0 Мочевина 1,0 KNOj1,0 KiHP04 0,5

5

NaCI0,5

Водопроводная .

водаОстальное

Время выра|цивания Л ч, температура .

Полученная клеточная суспензия служит посевным материалом для последующей ферментации.

10 литров питательной, среды приведенного состава разливают по 100 в О,,75 л колбы Эрленмейера, стерилизуют текучим паром при в течение 20 мин и засевают/ 24-х часовой культурой Pseudomonas mendocina 3121, выращенной на питательной среде в условиях аэрации при 27°С. Объем посевного материала на каждую колбу А мл. Ферментацию проводят в условиях аэрации на круговой качалке (220 об/мин) при в течение 120 ч.

б ) Способ получения эстеразы холестерин-олеата.

Культуральную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при +5°С на центрифуге К-70 или ЦДР-1 при 2500 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок удаляют.

К надосадочной жидкости порциями при постоянном помешивании (комнатная температура), добавляют охлажденный (-20С) этанол, до конечной концентрации 6S% и оставляют стоять в холодильнике (при помешивании) 30 мин. Появившийся осадок отделяют центрифугированием при тех же условиях.Надосадочнук) жидкость удаляют.

Полученный осадок суспендируют в минимальном объеме охлажденной дистиллированной воды (50 мл воды на весь осадок, полученный из 1 л культуральной жидкости).

Полученную суспензию высушивают

лиофильно с использованием жидкого азота (-195°С) до получения мелкодисперсного порошка - фермента-сырца, в котором определяют содержание белка по методу Lowry, 1951. Выход фермента-сырца 0,35 г на 1 л культуральной жидкости, содержание белка в препарате 29,2.

в) Определение специфической холестеролэстеразной активности.

В качестве субстрата для гидролиза используют олеат холестерина, поскольку он является основным эфиром

5

в атеросклеротической аорте (Himansku, 1973).

Приготовление раствора субстрата.

Эмульгатором субстрата является альбумин, активатором - дезоксихолат натрия. Оптимальное соотношение указанных ингредиентов олеата холестерина, альбумина, дезоксихолата 1:3:2.

Раствор субстрата готовят из расчета мг олеата холестерина в 1 мл по следующей схеме: холестериновый эфир олеиновой кислоты растворяют в минимальном количестве хлороформа в центрифужной пробирке с последующим удалением его в токе азота. После образования на стенках пробирки пленки добавляют 9,9 мг альбумина и 6,.6 мг дезоксихолата натрия.

Все ингредиенты растворяют в фосфатном буфере (,5) и го.чогенизируют трижды при 5000 об/ми.и в течение 5 мин (гомогенизатор MPW-32) .

Приготовление раствора фермента.

Препарат растворяют в фосфатном буфере (,5) из расчета 3,3 мг белка в 1 мл раствора.

Проведение субстратной ферментативной реакции.

Используют соотношение фермента м субстрату в реакционной смеси 1:2. Колбочки со смесью 2 мл раствора субстрата и 1 мл раствора фермента помещают на водяную баню (t ) . Реакция проходит при встряхивании в течение 30 мин, ее прерывают добавлением 3-х кратного количества смеси серного эфирз, гексана и этилового спирта (1:1:1). В контрольных варантах реакцию прерывают сразу же после добавления фермента к субстрату. Экстракцию продуктов гидролиза проводят той же смесью.

Высушенные неомыляемые остатки после проведения субстратной ферментативной реакции анализируют етодом г зожидкостной хроматограии с целью определения свободного хоестерина, образовавшегося при гидроизе эфира холестерина и олеиноой кислоты. Хроматограф 31, наолнитель chromaton N-AW Super с 3% иликона, колонка стеклянная 1,8 м, авление на входе в колонку 1,85 кг/см, температура .

Пробы перед анализом растворяют в смеси серный эфир: гексан 1:1, объем пробы для исследований 5/сР.

Расчет активности фермента.

За единицу активности холестеропэстеразы принимают количество фермента, катализирующее отщепление от холестеринаолеата годного микромоля холестерина в мин (Sugiura и др.,

1976). ;

В результате проведения ферментативной реакции по предложенной схеме 3,3 мг белка фермента за 30 мин катализирует отщепление QQ кг хоглестерина. Исходя из этого, единица активности фермента 96 мг, а специфическая удельная активность (количество единиц активности в 1 мг белка фермента) 0,01 ед/мг белка.

. Фермент-сырец из штамма Pseudomonas mendocina 3121 не обладает .яиполитической активностью (субстратоливковое масло).

П р и м е р 2, Получение холестеролэстеразы путем культивирования штамма-продуцента на среде с индуктором.

Для получения посевого материала штамм Pseudomonas mendocina 3121 выращивают в условиях аэрации на синтетической среде описанного составам Посевной материал, полученный после ч культивирования, вносят в количестве 4 мл в 0,75 л колбы Эрленмейера, содержащие по 100 мл среды следующего состава, г/л:

Глюкоза 20

Мочевина 1

К МОз 1

К,НР04 . 0,5

NaCI0,5

Олеат холе- .

стерина .3

Водопроводная

вода Остальное

-После 120 ч выращивания клетки отделяют центрифугированием и из культуральной жидкости получают фермент-сырец по методике как в примере 1i

Выход фермента 1,56 г на 1 л куль- туральной жидкости, содержание белка в последнем 18,2.

Единица активности фермента 23 мг, удельная специфическая активность 0,0 ед/мг белка.

Таким образом, штамм Pseudomonas mendocina 3121 продуцирует значительные количества фермента на простой синтетической среде в отсутствии индуктора В присутствии холестерина и его эфиров, взятых в качестве индукторов, специфическая активность синтезируемого фермента возрастает в 2-3 раза.

Способ получения холестеролэстеразы путем биологической ферментации прост, продуктивен, экономически выгоден. Холестеролэстераза из Pseudomonas mendocina 3121 может быть использована для количественного определения общего холестерина сыворотки крови при диагностике и лечении атеросклероза. Церебральных геморрагии и расстройств печени. Представляет интерес исследование возможностей применения этого фермента в качестве лечебного средства при атеросклерозе.

Формула изобретения

Штамм Pseudomonas mendocina (коллекция Центрального Музея института ВНИИгенетиКа, коллекционный номер ЦМПМ В-2173), продуцент холестеролэстеразы.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1,Патент Франции №2362927, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1978.

2.Авторское свидетельство СССР №2274686, кл. С 12 D 13/10, опублик 1976 (прототип).