Способ получения липопротеидлипазы Советский патент 1974 года по МПК A61K38/46 

Изобретение относится к фермент.ной промы 11леиности, в част тости к способам получения липопротеидлипазы. Известны способы получения л попротеидлипазы путем культивирования бактерий рода Pseudomonas, например Pseudomonas aerugiпоза, Pseudomonas fborescens, в аэробных условия .на питательной среде, содержащей источники углерода (глюкозу), азота (мясной бульон, пептон), индуктор (оливковое масло) п минеральные-соли (KHaPO i, MgS04). С целью повышения выхода фермента по гфедлатаемому способу в качестве продуцента липопротеидлипазы из бактерий рода Pseudomonas используют вид Pseudomonas aurantiaca, а в качестве индуктора - хиломикроны. При этом из вида Pseudomonas aurantiaca используют штамм ИНМИ-КП р.им ер. Посевную культуру Pseudomonas aurantiaca ИНМИ-К-выращивают на круговой качалке в течение 24 час. при 28°С на среде, содержащей 1% мясного бульона и 0,1% искусственных хиломикронов. Затем полученный посевной материал в количестве .5 мл переносят в колбы, содержащей 50 мл питательной среды следующего состаМясной булЬО Пептон Глюкоза КН,РО40,2 MgSO40,05 Хиломикроны0,1 ВодаОстальное и осуществляют культивирование при 28С на круговой качалке при 200-300 о-б/мин, в течение 48 час. Через 48 час в среде .накапливается липопротеидлипаза в количестве 0,5 г на 1 л. Выход фермента определяют титрованием освобождающихся при г -1дролнзе хиломикронов высших жирных кислот по методу Дола. При пересчете на граммы удельная активность липопротбидлилазы равна 2500 мк.моль высших лсирных К гелот (час) мг. белка. Фермент липопротеидлипаза, как и липаза, .ется гидролазой триглицеридов, но в отличие от обычных липаз гидролизует триглицериды, входящие в состав хиломикронов и других липонротеидов плазмы кровг с очень низкой плотностью. Полученный фермент может быть применен в медицине для лечения нарушений липидного обмена, а также в производстве вакцин. Характеристика щтамма Pseudomonas auTantiaca ИНМИ-К. Штамм выделен из ожных почв Советского Союза. Морфология. Палочки мелкие, бесспоровые, подвижные, размером 2-3X0,5 мк. Имеет поляр.но расположенные жгутик в количестве

5-/ штук. Грамотрицательный.

Культуральные и физиолого-биохимические признаки.

На мясопептонном агаре образует крупные блестящие колонии оранжевого цвета. В субстрат выделяет оранж-ево-красный флуоресцирующий пигмент. На мясопептонном бульоне образует обильную муть оранжевого цвета и кольцо на стенках пробирки. Штамм синтезирует смесь окрашенных флуоресцирующих и нефлуоресцирующих пигментов различного химического состава. Хорошо растет на средах с картофелем и солодовом сусле. Штамм хорошо растет с образованием пигмента пр/и 28°С, при 4°С наблюдается рост, но без образования .пигмента.

Желатину разжижает.

Молоко пептонизирует.

Крах.мал и клетчатку не разлагает.

Индол и сероводород не образует.

Отношение к источнику углерода.

Использует с подкислением среды арабинозу, ксилозу, глюкозу, маннозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сорбит, маннит .и глицерин.

Ассимилирует лимонную, янтарную, фумаровую, глюконовую, 2-кетоглюконовую кислоты.

Не растет на синтетических средах с углеводородами п ароматическими соединениями (бенЗОЙКОЙ, салицило)вой, т-ал1инобензойной кислотами, фенолом) за исключением а:нтраниловой кислоты.

Источники азота. Использует хларистый аммоний, мочевину и аминокислоты.

Аэроб, го.моферментативен.

Проверка патогенности Pseudomonas проводилась сравнительно с условно патогенными штамма и Pseudomonas aeruginosa. Внутрибрюшинное введение суспензии Pseudomonas aurantiaca ИНМИ-К не вызвало гибели мышей, в то время при введении суспензии Pseudomonas aeruginosa попибло 90% мышей.

Предмет изобретеппя

1.Способ получения липопротеидлипазы путем аэробного культивирования бактерий рода Pseudomonas на питательной среде, содержащей индуктор фермента, источники углерода, .а-зота и минеральные соли, с последующиим выделением фермента «з культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, в качестве продуцента липопротеидлипазы из бактерий рода. Pseudomonas используют вид aurantiaca, а в качестве индуктора - хиломикроны.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что из вида Pseudomonas aurantiaca используют штамм ИНМИ-К.