Способ получения активатора автолиза микроорганизмов Советский патент 1982 года по МПК C12N1/06 

(St) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВАТОРА АВТОЛИЗА Изобретение относится к микробиоло гической и медицинской пррмышленности в частности к способам получения акти ватора автолиза микроорганизмов. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения активатора автолиза микроорганизмов, предусматривающий гидролиз исходного сырья трипсином. Согласно известному способу регуляторы автолиза выделяют из ферментолизата биомассы микроорганизмов путем экстракции 5 10%-ной трихлоруксусной кислотой с последую1цим осаждением из экстракта объемами органических растворителей. Ферментативному лизису подвергают суспензии биомассы с концентрацией сухих веществ . Для лизиса используют на первой стадии (врмент литимеского действия, на второй стадии - фермент протеолитического действия, например трипсин. МИКРООРГАНИЗМОВ при соотношении фермент ; субстрат 1:500 С1. К недостаткам известного способа относится то, что регулятор автолиза ; может Использоваться как для активации, так и для торможения автолиза. Характер действия регуляторов зависит от субстрата (автолизирующейся бактерииJ, Поэтому для выбора регулятора заданного характера действия на данный микроорганизм требуется проверка действия серии регуляторов, чтр осложняет проблему применения регуляторов автолиза на практике. Кроме того, недостатками известного способа являются также сложность процедуры выделения регуляторов и необходимость специального оборудования, устойчивого к действию трихлоруксусной кислоты. Цель изобретения - .упрощение способа, а также повышение эффективности действия активатора автолиза. 396 Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения активатора автолиза микроорганизмов, предусматривающему гидролиз исходного сырья трипсином, гидролизу подвергают казеин или казеинат натрия, а гидролиз ведут в течение 0, ч при соотношении фермент : субстрат равном 1:1000 - 1:5000. Способ осуществляют следующим образом. Казеин или казеинат натрия растворяют в воде, концентрация белка - от 1 до 5%. При необходимости для улучшения растворения суспензию белка подогревают до 60-8()-С. По окончании процесса растворения температуру раст JBOpa снижают до и устанавлиеают рН 8-9 с помощью раствора NaOH. Затем в раствор вносят фермент трипсин, соотношение фермента к субстрату от 1:1000 да 1:50.00. Ферментативный гидролиз проводят при в течение, 0,5-2 ч, предпочтительно 2 ч. По окончании гидролиза температуру гидролизата повышают до 90 100°С и выдержи.вают при этой температуре 1530 мин для инактивации фермента. Затем гидролйзат охлаждают и высушивают лиофильно или на распылительной сушилке. При этом в качестве наполнителей могут быть использованы соли например поваренная соль, сульфат аммония и др.- (в зависимости от целевого назначения препарата), количество вносимых при сушке солей 50-150 к сухой массе гидролизованного белка. В качестве гидролизуемого субстрата можно использовать не только казеин или казеинат, но и другие белки, например молочный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатину, но получаемый при этом активатор автолиза обладает менее выраженным действием, Универсальность активирующего действия на автолиз различных микроорганиз мов сохраняется. Наиболее активная фракция активато ра, получаемого из казеина или казеината натрия, содержит пептиды с моле кулярной массой 800-1000 дальтон. С целью повышения эффективности активатора эта фракция может быть выделена из гидролизата методом гельфильтрации на сефадексе или акрилексе. Пример 1.50г казеината нат рия растворяют в 1 л воды при , охлаждают раствор до , устанавливают рН 8,6 с помощью 1 -ного раствора NaOH и добавляют 0,01 г трипсина в виде водного раствора в объеме 0,01 л (соотношение фермента к субстрату 1 :soon ). Гидролиз ведут при и постоянном перемешивании в течение 2ч. Затем гидролйзат нагревают до киПения и выдерживают в кипящей водяной бане 15 мин, после чего охлаждают и лиофилизируют. Полученный препарат используют для активации автолиза микроорганизмов. Для определения степени активации автолиза приготавливают однородные водные суспензии биомассы различных микроорганизмов со стандартной оптической плотностью 0,951,05 при измерении на ФЭК-56М при длине волны 5tO нм в кювете толщиной 5 мм. Затем составляют реакционные смеси из равных объемов стандартной суспензии и водного раствора активатора концентрации t мг/мл. В контроле к стандартной суспензии приливают рав|1ый объем воды. Измеряют исходную on-j тическую плотность реакционной смеси DO и оптическую плотность после инкубации в течение часа при 37°С - . Вычисляют интенсивность автолиза 3 3 , 100. Полученные результаты приведены в таблице, варианты 1-10 (.при продолжительности гидррлиза 2 ч и соотношении фермент : субстрат 1 : 5000), Из таблицы видно, что в вариантах интенсивность автолиза микроорганизмов возростает в 2,9-15 раз по сравнению с контролем, а в вариантах 1 и 2 наблюдается высокая интенсивность автолиза у микроорганизмов, которые в отсутствие активатора не лизировались. Это может объясняться переходом латентной формы автолитических ферментов в активную в присутствии активатора автолиза. Пример 2. 100 г казеина растворяют в 2 л воды при 75°С,охлаждают раствор до , устанавливают рН 9,0 с помощью 1 -ного раствора NaOH и добавляют 0,10 г трипсина в виде водного раствора в 0,10 л воды (соотношение фермент : субстрат 1:1000} Гидролиз ведут при в течение 0,5 ч. Затем гидролйзат выдерживают в кипящей водяной бане в течение 30 мин, после чего охлаждают и лиофилизируют. Полученный препарат используют для активации автолиза микроорганизмов. Определение степени активации проводят так, как описано в примере 1.

Полученные результаты приведены 5 в таблице, варианты 1Т-13 (при продолжительности гидролиза 0,5 м и соотношении фермент : субстрат 1:1000). Под действием активатора интенсивность автолиза метаноокисляюцих бактерий, to культура 170, повышается в А,2 раза, Е. соП Н 17 в 6,П раз, а у актиномицета Streptomyces albogrlseotus - от О до 52,8%.

Пример 3. 50 г казеината натрия растворяют в 2 л воды при ., охла чдают раствор до k2°C, устанавливают pti 8,6 и добавляют 0,02 г трипсина в виде водного раствора в объеме

Влияние активатора на интенсивность автолиза

0,02 л. Соотношение фермент ; субстрат равно 1:2500. Гидролиз ведут при 37°( в течение ч. Затем гидролиза нагревают до кипения и выдерживают в таком состоянии 20 мин. По охлаждении гидролизат лиоЛилизируют.

Испытание активирующего дейст вия препарата наавтолиз микроорганизмов проводят так же, .как в примере 1. , Результаты приведены в таблице, арианты (при продолжительност гидролиза Л ч и соотношении фермент : субстрат 1:2500). Степень активации автолиза составляет для метаноокисляюцих бактерий, культуры 122 и 170, соответственно 2,7 и 4,3 раза, для Е. сЫ I MRF.-бОО - И,5 раза, у 8. nesentericus 1 интенсивность автолиза повышается от О до 18,7-5. микроорганизмов

Streptonyces a1bogriseolus

В. Mesentericus 1

Bif fdobacteruin E.coli MRE-600

P.. соП M17

Метаноокисляю1чие бактерии, культура 122

Метаноокисляюцие бактерии, культура 170

Lactobact.plantsrun

Candida tropical is ВСБ-909

Rhdotorula aurant iaca

16,2 2,9

i,

27,3 20,9 3,0 14,1 2,9 25,0 3,0

11Метаноокисляющие бактерии, культура 1706,2

12Е, соП М17 5,1

13Streptornyc s altjogrlseolusО

ИМета нос кйсляю1цие

бактерии, культура 1706,1

:.Ш 15Мет аноо ки с л я ю|ди е

бактерии, культуполучения активатора автолиза микроо ганизмов обеспечивает получение высо коэффективного активатора автолиза, который, по сравнению с известным способом позволяет активировать авто лиз представителей всех групп микроорганизмов. Кроме того, достигается упрощение за счет исключения стадии обработки трихлоруксусной кислотой. Формула изобретения Способ получения активатора автолиза микроорганизмов, предусматрива969715

.8 Продолжение таблицы

.2 6,0

26,2 i,3 НОМ, о т л и ч а ю ц и и с я тем, что, с целью упро1чения способа, а также повышения эффективности действия активатора автолиза, гидролизу подвергают казеин или казеинат натрия, а гидролиз ведут в течение 0,5-2 ч при соотношении фермент :субстрат равном 1:1ПОО - 1:50ПО. Источники информации, принятые во внимание пр1 кспертизе 1. Авторское свидетельство СССР Vf 759526, кл. С 07 R 7/0,2, 1978.