Способ идентификации ингибиторов L-амилаз Советский патент 1982 года по МПК C12Q1/40 

(SJ) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБИТОРОВ OL-АМИЛАЗ

Изобретение относится к защите и биохимии растений, а также к физио логии -пищеварения. Известны способы выявления компонентов амилаз в электрофоретических спектрах белков посредством проведения ферментативных реакций в разделяющем геле 1. Однако эти методы не позволяют вы явить ингибиторы ci-амилаз. Наиболее близким является способ проведения электрофореза белков-инги биторов из зерна пшеницы с последующим выделением отдельных компонентов из геля для определения ингибирующей активности. Для этого белки фракционируют высаливанием сульфатом аммония и различными методами хроматографии. Разные фракции белков разделяют электрофорезом в 7, полиакрил амидном геле при рН 8,9 по Орнштейну и Дэвису. Зоны, содержащие с отдельные компоненты, вырезают из геля и из них выделяют белок. В случ препаративного электрофореза отдельные компоненты элюируют из геля. Активность ингибиторов определяют обычными методами в пробирках 2. Однако известные способы требуют высокой очистки белков-ингибиторов, что сопряжено с использованием сложных приборов и большими затратами времени. Это затрудняет массовый анализ образцов. Цель изобретения - повышение разрешающей способности и производительности способа. Указанная цель достигается тем, что электрофорез проводят в полиакриламидном геле, содержащем крахмал и d-амилазу в концентрации, достаточной для полного разрушения крахмала, после электрофореза гель инкубируют при 20-37С и рН 5,-7,0 30-90 мин и окрашивают раствором йода. Белки выделяют из муки 3-кратным объемом трис-глицинового буфера в течение -12 ч при °С. После центрифугирования экстракт прогревают на водяной бане Ю-+О мин при 70-90С для инактивации собственных амилаз зерна. После этого 1-15 мкл белка наносят на -гель для электрофореза. Электрофорез проводят в турбках или пластинах.5,8 -ного полиакриламидчого геля. Гель содержит 0,,10 крахмала и исследуемую о6-амилазу в концентрации, достаточной для полного разрушения крахмала в геле за 1 ч при оптимальных для фермента условиях Так как рН буфера в геле, равный 8,3, отличается от оптимального для многих dL-амилаз, в процессе разделения белков фермент неактивен. Низкая ионная сила буфера (0, М трис-0,057М глицин) позволяет быстро изменить рН в геле для активации фермента после электрофореза. Для этого гель поме в буфер с рН 5,-7,0,. оптимальи«м для изучаемой ot-амилазы. Оптималь ней рН буфера для оС-амилаз насекомых 5,, а для d-амилаз млекопитающих 7,0 dL-Амилаза разрушает весь крахмал в геле за исключением тех зон, в которых присутствует специфичный ингибитор данного фермента. Другие белки не препятствуют действию амилазы. Зоны, в которых остается неразрушенный крахмал, окрашиваются раствором иода в синий цвет-. Гель фотографируется на фотопленку в проходящем свете. Сте пень специфичности отдельных компонен тов ингибитора можно определить количественно на денситометре. Пример. Определение ингибиторов cL-амилазы кишечника вреднс й черепашки. Несколько зёрен; размалывают-в муку. В 100 мг муки заливают ЗОП мкл 0,007 М трис-0,057 М глицинового буфера и оставляют на 4 ч при с. Смесь центрифугируют при 8000 об/мин Надосадочную жидкость прогревают 15 мин при для инактивации амилаз зерна. Электрофорез проводят в го ризонтальных пластинах полиакриламидного геля 1251252,1 мм. Гель имеет 10 лунок для нанесения образцов. Состав геля в расчете на 100 мл смеси: акриламид 5,8; метилен-бис-акриламид ,0,21 г; ТЕМЕД 0,05 мл; раствор рибофлавин 5 мл ( мг/100 мл) (добавляют непосредственно перед полимеризацией) Смесь доводят до 100 мл трис-глициновым буфером рН 8,3, содержащим 0,1% крахмала. В раствор добавляют ot-ами1лазу из кишечника клопа в концентраци достаточной для разрушения всего крахмала в геле- за 60 мин в буфере с рН З, и при 37°С . Эту концентрацию подбирают предварительно обычными методами в пробирках. Гель полимеризуют на свету в течение 30 мин. В качестве электродного используют то.т же буфер, что и в геле. Исследуемый раствор белка наносят в лунки для образцов. При размере лунки мм наносят 15 мкл экстракта. Электрофорез ведут с охлаждением при 10°С , в течение 60 мин при силе тока 25 мА и напряжении 700 В. После электрофореза гель помещают в ацетатный буфер с рН 5,,содержащий 0,1 М NaCl и 0,001 М CaCl,2i. Гель инкубируют в буфере 60 мин при З7с и помещают в раствор иода (100 мг иода и 300 мг KI на 0,5 л воды). Зоны,в которых присутствуют ингибитор сЬ-амилазы черепашки, окрашивается в синий цвет. Гель фотографируют в проходящем свете. Для изучения количественных характеристик спектра продуктов реакции ингибирования гель сканируют на денситометре. Для контроля часть спектров альбуминов зерна проявляют на белок в 10%-ной трихлоруксусной кисло ®П р и м е р 2. Проводят те же операции по выделению белка, как в примере 1. Надосадочную жидкость прогревают 10 мин при 70°С. В таких услоВИЯХ активность ингибиторов сохраняется лучше, но есть вероятность того, что амилазы зерна инактивируются не полностью. Это может исказить результаты анализа. Состав геля -. как в. примере 1, но ,paциякрахм ала1 0,05. Наносят 5 мкл образца на лунку. Спектр продуктов реакции ингибирования ot-амилазы может получиться недостаточно контрастным. П р и м е р 3. Те же операции, что и в примере ,но Надосадочную жидкость прогревают ЦО мин при ЭО-С. Ингибиторы могут потерять значительную часть своей активности, зато собственные амилазы зерна инактивируются полностью. Такие условия могут быть полезны при работе с образцами, в которых трудно йнактивировать амилазы, например с белками незрелого или пророщенного зерна, Если концентрация игибиторов в экстракте намного выше, чем в примере 1, то при нанесении 15 мкл образца на лунку отдельные компоненты ингибиторов могут слиться, что затруднит анализ. При недостаточном охлаждении гель мо жет нагреться в ходе электрофозера. При нагреве до температуры выше et-амилаза в геле может активироваться, что исказит конечною результаты. Пример. Для идентификации ингибиторов (/.-амилаз слюны человека, панкреаса свиньи и собственных ot-ами лаз пророщенного зерна условия осу.ществления способа Те же, что и в примере 1. Однако оптимальное количество наносимого на гель экстракта меняется в зависимости от чувствител ности сз -амилазы к ингибиторам. На гель с ot-амилазой слюны человека наносят 0,5-2,0 мкл, панкреаса свиньи - 3-5 мкл и пророщенного зерна 12-15 мкл. Гели с оС-амилазами челове ка и свиньи инкубируют в трис-верона ловом буфере рН 7,0, а зерна - в аце татном буфере рН 5,. П р и м е р 5. Для идентификации .ингибиторов ot-амилаз мучного хруща ка в условия осуществления способа, описанные в примере 1, необходимо внести некоторые изменения. Поскольку ct-амилаза хрущака обладает более высокой подвижностью в электрофорезе чем пшеничные ингибиторы, разделяю дий гель полимеризуется так, чтобы 204 лунки для образцов находились посредине между катодным и анодным концами геля. Длина геля 250 мм. Это позволит компенсировать высокую подвижность фермента. В связи с очень высокой чувствительностью фермента к ингибиторам количество наносимого экстракта необходимо уменьшить в раз по сравнению f примером 1. формула изобретения Способ идентификации ингибиторов о1-амилаз, включающий электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что, с целью повышения разрешающей способности и производительности, электрофорез проводят в полиакриламидном геле, содержащем крахмал и ct-амилазу в концентрации, достаточной для полного разрушения крахмала, после электрофореза гель инкубируют при 20-37°С и рН 5,-7,0 30-90 мин и окрашивают раствором йода. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Маурер Г. Диск-электрофорез. 1971. 2.Biochim. Biophis. Acta, 1973, V. 317, p. 139-148.