Способ идентификации ингибиторов гидролаз Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/40 

Изобретение относится к энзимологии и биотехнологии и может быть использовано в биохимии растенийлл животных, в частности в работах по биохимии иммунитета растений к вредным организмам, а также в медицинской биохимии для идентификации ингибиторов индивидуальных компонентов сложных смесей гидролаз.

Цель изобретения - упрощение и повышение разрешающей способности способа идентификации ингибиторов отдельных компонентов смесей гидролаэ.

П р и м в р 1. Идентификация белков зерна пшеницы - ингибиторов компонентов а -амилаз насекомых.

Белки-ингибиторы извлекают из 1 г муки пшеницы 2-кратным объемом воды в течение 1 ч. Смесь центрифугируют, прогревают на досад очную жидкость 10 мин при 80°С для инактивации ft - амилаз и вновь центрифугируют, осадок отбрасывают.

а - Амилазы извлекают, гомогенизируя личинки зернового точильщика

О

00 О 4

43

Rhyzopertha dominlca F. с 4-кратным обье- мом 0,1 %-ного CaCl2.

Полимеризуют два 6% ПААГ, толщиной 0,2 мм, содержащие 2% амфолин, рН 5-8 для ингибиторов, и 2% сервалитов, рН 3-7 для а -амилаз.

Ингибиторы и а -амилазы наносят на гели с помощью полосок фильтровальной бумаги 10x100 мм. Проводят изофокусиро- вание на приборе при расстоянии между электродами 100 мм. Готовят 6% ПААГ-ре- плику толщиной 0,2 мм на подложке, содержащей 0,1 М Na-ацетатный буфер, рН 5, и 0,4-ный крахмал. После изофокусирования реплику накладывают на гель с ингибиторами на 10 мин, затем ее переносят на гель с а. -амилазами так, чтобы компоненты белков-ингибиторов и а-амилаз пересекались под прямым углом, и инкубируют 30 мин при 37°С.Реплику помещают в раствор иода (1 г32 и 5 г KJ на 1 л воды). Компоненты а -амилаз проявляются в виде прозрачных полос на синем фоне. В зонах пересечения компонентов а -амилаз и их ингибиторов линии а-амилаэ сужаются или прерываются. Все основные компоненты а- -амилаз зернового точильщика ингибируют- ся сходными компонентами белков зерна пшеницы.

П р и м е р 2, Идентификация ингибиторов компонентов а-амилазы прорастающего зерна пшеницы.

Фракцию белков, содержащую ингибиторы, экстрагируют из 10 г муки пшеницы 2-кратным объемом воды. После центрифугирования методом аффинной хроматографии на субтилизин-сефарозе очищают бифункциональные ингибиторы а -амила- зы/субтилизина. а -Амилазы экстрагируют 5-кратным объемом 0,1 %-ного CaCte из прораставших в течение 3 дней при 22°С и затем высушенных и размолотых зерен пшеницы. Экстракт прогревают 5 мин при 71°С для инактивации а - амилаз.

Полимеризуют два 6% ПААГ, содержащих 2 % амфолин, рН 5-8, для фракционирования ингибиторов и 2% сервалитов, рН 3-10, для а. -амилаз. Гель для а -амилаз полимеризуют на подложке.

Ингибиторы (200 мкг/мл) наносят с помощью бумажной полоски 5x80 мм, которую накладывают на гель в 20 мм от анода параллельно электродным полоскам.

Раствор а -амилазы разбавляют в 5 раз и наносят полоской 10x80 мм в 50 мм от анода. После изофокусирования часть геля на подложке со спектром а - амилаз вырезают и накладывают на гель, на котором разделялись ингибиторы, так, чтобы угол между линиями компонентов белков и а -амилаз составлял 90°. Через 30 мин гели разъединяют и на них накладывают заполимеризо- ванные на подложке гели-реплики, содержащие 0,1 М NaH2P04 и 0,4%-ный крахмал, и инкубируют при 37°С 30 мин. Реплики погружают в раствор иода. В зонах

пересечения со специфичным компонентом ингибиторов компоненты а - амилаз прерываются,

Формула изобретения

1. Способ идентификации ингибиторов

гидролаз, включающий раздельную экстракцию гидролаз и их ингибиторов из исходного сырья, фракционирование ингибиторов гидролаз в пластинах геля,

пространственное совмещение геля, содержащего спектр ингибиторов гидролаз, с гелем, содержащим ферменты класса гидролаз, в присутствии субстрата реакции, с последующим определением активности

гидролаз в зонах их пересечения с ингибиторами и идентификацией ингибиторов гидролаз по активности гидролаз, отличающийся тем, что. с целью упрощения и повышения разрешающей способности

способа, полученный экстракт гидролаз непосредственно фракционируют в пластинах геля и полученные пластины, содержащие спектр гидролаз, используют для пространственного совмещения с гелем, содержащим спектр ингибиторов гидролаз.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что совмещение спектров ингибиторов и гидролаз осуществляют путем наложения геля, содержащего спектр ингибиторов, на

гель, содержащий спектр гидролаз, так, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаз пересекались под прямым углом, затем пластины гелей разъединяют и на каждый из них накладывают гель, содержащий субстрат реакции.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что совмещение спектров ингибиторов и гидролаз осуществляют путем последовательного наложения геля, содержащего субстрат реакции, на гель, содержащий ингибиторы, и затем на гель, содержащий гидролазы, так, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаз в геле, содержащем субстрат реакции, пересекались под прямым углом.

Изобретение относится к энзимологии и биотехнологии и может использоваться в биохимии растений и животных, в частности в работах по биохимии иммунитета растений к вредным организмам, а также в медицинской биохимии для идентификации ингибиторов индивидуальных компонентов сложных смесей гидролаз. Целью изобретения является упрощение и повышение разрешающей способности способа идентификации ингибиторов отдельных компонентов смесей гидролаз. На пластины гелей наносят препараты, содержащие ингибиторы и гидролазы, и проводят их раздельное фракционирование электрофорезом, изофокусированием или другими методами, после чего обеспечивают условия для перекрестного взаимодействия компонентов спектров ингибиторов и гидролаз. Для этого накладывают один гель на другой или последовательно снимают реплики с гелей таким образом, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаз пересекались под прямым углом. В результате диффузии компонентов из геля в гель происходит их пространственное совмещение в точках пересечения. Это делает возможным биохимическое взаимодействие компонентов ингибиторов и гидролаз. В гелях или репликах выявляют компоненты гидролаз по активности. В точках пересечения компонентов гидролаэы с их специфичными ингибиторами полосы ферментов сужаются или прерываются. 2 з.п. ф-лы.