Способ идентификации ингибиторов @ -амилаз Советский патент 1985 года по МПК C12Q1/40 

ел

Gb Изобретение относится к биохимии растений и может быть использовано для защиты растений, в общей биохимии и биохимии пищеварения, генетике и селекции растений. Цель изобретения - повьпиение разрешающей способности способа. Пример. Идентификация ингибиторов «С-амилазы мучного хрущака. 10 мг муки пшеницы или другого знака заливают 0,2 мл 2 М мочевины и оставляют на 18 ч при 4°С. Экстрак цию проводят в лунках пластмассовой кассеты, предназначенной для 60 образцов. Кассету помещают в термостат на 20 мин при . Раствор белка наносят на пластину разделяющего тела при помощи полосок фильтровальной бумаги 5-3 мм, впитавщих по 3мкл экстракта. На одной пластине разделя ющего геля анализируют одновременно 40 образцов. Гель содержит 5,8% акриламида, 0,25% метиленбисакриламида, 1% амфолин (ЪКВ) рН 5-8 и 2 М мочевину. Для приготовления геля размером 240-120-1 мм к 30 мл дегазированного раствора добавляют 30 мк ТЕМЕДа и 1,5 мл раствора рибофлавина (4 мг на 100 мл). Разделяющий гел помещают на охлаждающую пластину прибора Мультифор или другого прибора подобного типа. В качестве элек тродов служат бумажные полоски, смоченные 0,1 М NaOH (катод) иО,5М 72 фосфорной кислоты с 0,1 М глутаминовой кислотой (анод. Разделение ведут 2 ч при напряжении 1800 В, после чего удаляют электродные полоски и на разделяющий гель накладывают гель-реплику следующего состава 5,8% акриламид, 0,25% метиленбисакриламид, 2 М мочевины, буфера рН 8,3, содержащего 0,0074 М трис и 0,057 М глицина, 0,1% крахмала и с -амилаз мучного хрущака в концентрации, достаточной для разру1иения всего крахмала в геле за 30 мин при оптимальных условиях. Размер геля 240-120-2 мм. Разделяющий гель и гель-реплика находятся в контакте 30 мин при 20°С, после чего гель-реплику помещают в ацетатный буфер рИ 5,4, содержащий 0,1 М NaCl и 0,001 М CaCl2- Гель инкубируют в буфере при 37°С. За степенью разрушения крахмала следят, отрезая небольшие участки с краев геля и помещая их в раствор иода. Когда эти участки начинают приоЬретать оранжевую окраску, гель-реплику заливают раствором иода (100 мг иода и 500 мг йодистого калия на 0,5 л воды ). Зоны, содержащие ингибиторы rt -амилазы насекомоГель фотографируют на фотопленку в проходящем свете. Окрашенные пластины геля могут храниться в растворе, иода несколько недель.

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШГИБИТОРОВ ci-АМИЛАЗ путем фракционирования белков в гелях с использованием пластины полиакриламидного геля, содержащей крахмал, о -амилазу и.буфер с рН, отличным от оптимального, инкубации геля в буфере при оптимальных значениях рН и температуры с последующей окраской иодом, отличающийс я тем, что, с целью повьшения разрешающей способности способа, фракционирование проводят в гелях, не содержащих крахмала й -амилазы, затем накладывают на разделяющими гель гельреплику, содержащий крахмал и (З -амилазу, и выдерживают в течение 3090 мин. (Л С