Способ выявления каталазной активности в биологических объектах Советский патент 1988 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине.

Целью изобретения является упрощение способа выявления каталазной активности,

Способ выявления каталазной активности предусматривает формирование в качестве поддерживающей среды дл.я электрофореза полиакриламидного геля с добавлением к последнему крахмала, проведение щелочного электрофореза h последующее окрашивание йодистым калием, крахмал вводят на стадии подготовки раствора надсернокислого аммония для разделяющего геля, а окра- й ивание осуществляют с предобработкой в растворе перекиси водорода рН 7,0 и последующей инкубацией в растворе уксусной кислоты, при этом время вьщерживания геля в каждом из Ьтих растворов составляет 3-10 мин, а концентрация крахмала в растворе надсернокислого аммония не должна быть выше- 0,5%. Предлагаемое использование крахмала не изменяет градиенты рН и системе, подготовленной для электрофореза, а следовательно, разрешающую способность полиакриламид- кого геля. Введение крахмала на стадии подготовки,раствора надсернокислого аммония для разделяющего геля создает оптимальные режимы для дегазации раствора и распределения крахмальных частиц в нем, что облегчает окрашивание фермента. Последующее выявление ферментативной активности йодистым калием достигают предварительной обработкой в 1%-ном растворе перекиси водорода рН 7,0-и инкубацией в 1%-ном растворе уксусной кисло- ты. Данную рН раствора перекиси водорода поддерживают соответствующей для фермента буферной системой.

При осуществлении способа все операции выполняются в определенной последовательности. Сначала приготавливают электродный буфер и рабочие растворы для формирования геля. При приготовлении раствора надсернокислого аммония вводят крахмальный золь. При этом концентрация крахмала в раствор надсернокислого аммония составляет 0,5%, Полимеризацию геля осуществляю в кварцевых или стеклянных трубках. Далее на торцовую поверхность геля наносят ферментную пробу. Электрофорез ведут в щелочной системе при постоянных рН, температуре и подаче нап0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ряжения к электродному буферу. По окончании электрофореза.гели освобождают от электрофоретических трубок и, снижая. рН геля, осуществляют процедуру окрашивания. При этом гели вначале инкубируют 3-10 мин в растворе перекиси водорода, зат ем в растворе уксусной кислоты в течение такого же времени и далее обрабатывают раствором йодистого калия, .

Введение крахмала на стадии приготовления раствора надс ернокислого аммония для разделяющего геля в предлагаемом способе имеет также преимущество по сравнению с известным в связи с тем, что небольшая навеска катализатора фотополимеризации (т.е. персульфата) по сравнению с навесками ингредиентов, входящих в остальные растворы, в частности Ащ и Вщ, облегча.ет формирование геля и повышает его целостность. Введение крахмала на конечной стадии формирования геля делает способ надежным. Кроме того, приготовление раствора метилен- бисакриламида требует повышения температурных режимов по сравнению с та ковыми при образовании крахмального золя. .

На фиг.1 показана схема электро- фореграмм образцов после выявления их на каталазную активность, где 1 - каталазная aктивнoctь печени быка 2 - каталазная активность листьев яровой пшеницы Саратовская-291 3 - каталазная активность листьев озимой пшеницы Мироновская-808; 4 - каталазная активность пероксидазы хрена; ОЭП - относительная электрофоретичес- кая подвижность; на фиг.2 - схема, электрофореграмм зерна пшеницы, где 1 - яровой, 2 -, озимой, ОЭП - относительная электрофоретическая подвижность; на фиг.З - схема рН-значений системы для электрофореза, где 1 - электродный буфер, 2 - концентрирую- щий--гель, 3 - разделяющий гель.

Пример 1. Выявление каталазной активности печени быка осуществляют следующим образом. Сначала формируют полиакриламидный гель..Для эт.ого приготавливают запасные водные растворы. По щелочной системе они следукщего состава: А

л щ

1 н. НС1 48 МП

трис-Гидромексилметил аминометан 36,6 г

тетрамеиамин

Бц

ксилметил)

В(ц

акриламид

Щ

акриламид

Д

U(

0,23 МП Остальное (до 100 мл)

48 мл

5,98 г

0,46 мл Остальное (до 100 мл)

28 г 0,735 г Остальное (до 100 мл)

4

10 г

2,5 г Остальное (до 100 мл)

4 мг.

Остальное (до 100 мл)

Сахароза

Вода

40 г

Остальное (до 100 мл)

аминометан

Глицин Вода

Аммоний надсер нокисльй 140 г Крахмальный золь

, Раствор, содержащий надсернокислый аммоний и крахмал, пд)йготавливают только в день его использования. При этом сначала при температуре вьше 70 С получают из крахмала жидкий золь. Используют картофельный растворимый крахмал для йодометрии. Концентрация его в растворе персульфата не

6,0 г 28,8 г Остальное - . (до 1000 мл)

Электродный буфер должен быть ох- Остальное лажденным до- . Электрофорети- (до 100 мл) 35 веское разделение ферментного препа- , рата ведут в указанной температуры. Подача тока на трубку соответствует 2,7 мА. В- качестве источника тока служит УИП-1. Время элек- 40 трофореза 2 0,3 ч. По окончании этого процесса гели освобождают из трубок под давлением жидкости, в качестве которой применяют электродный буфер, подаваемьш из медицинского

)

)

)

)

)

)

422121

уровень жидкости. Для этого на торцовую часть трубок с помощью медицин- .ского шприца типа Рекорд на 2 мл

осторожно наслаивают 0,3 мм б йдистил- лированной воды. Полимернзуют гели в темноте при 33°С. По окончании этой стадии осуществляют осушивание геле- вой поверхности узкими полосками .

10 фильтровальной бумаги, после чего на-г- слаив-ают слой концентрирующего геля. Концентрирующий гель образуют из растворов Б, Гц, Ду, ЕцВ соотношении 1:2:1:4 соответственно. Устанавливают

15 уровень концентрирующего геля так же, как. и в случае разделяюа1его. Полимеризацию осуществляют при комнатной температуре в условиях дневного света или подсветки. Далее наносят фермент 20 ную пробу (3 мМ) каталазы печени быка в количестве 35 мкл на трубку с градиентом сахарозы и начинают электрофорез . В качестве электродного буфера служит трис-глициновый рН 8,3, кото-

25 рьм пер& д употреблением разбавляют в 10 раз. Исходный его раствор сос тавляют следующим образом:

трис-Гидроксилметид- .аминометан

Глицин Вода

6,0 г 28,8 г Остальное - . (до 1000 мл)

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, в частности к способу выявления активности ферментов. Целью изобретения является упрощение способа выявления каталазной активности. Новым ,является то, что в способе выявления каталазной активности формирования в качестве поддерживающей среды для электрофореза полиакриламид- ного геля с добавлением к последнему крахмала, проведения электрофореза и последующего окрашивания йодистым калием крахмал вводят на стадии подготовки раствора надсернокислого аммо. ния для разделя ющего геля, а окрашивание осуществляют с предобработкой в растворе перекиси водорода рН 7,0 и последующей инкубацией в растворе уксусной кислоты, при этом время выдерживания геля в каждом из этих растворов составляет 3-10 мин, а концентрация крахмала в растворе надсер-ч нокислого аммония не должна быть выше 0,5%. Предлагаемьй способ отличается от известного большей надежностью и позволяет выявлять каталазную активность в образцах растительного . и животного происхождения. Последовательное введение ингредиентов в способе позволяет поддерживать целостность полнакриламидного геля, его высокую разрешающую способность и не- обходигАю рН-градиенты. 3 ил., 2 табл. (Л

должна быть выше 0,5%. После охлажде- 45 шприца типа Рекорд на 20 мп . За пения крахмального золя до 25-27 С в него вносят над сернокислый аммоний и Тщательно перемешивают. Разделяющий гель формируют путем смешивания ис-

риод электрофореза устанавливают пробирки в штативе и заполняют их 1%- ным раствором перекиси водорода рН 7,0 (субстрат для фермента). Дан2щ в

соотходных растворов Ац, Вц, ношении 1:2:4 соответственно, после чего добавляют 1 ч. воды и проводят дегазацию с помощью вакуумного насоса Затем смесь помещают в электрофо- ретические трубки (кварцевые или стеклянные), устанавливают на горизонтальные подложки. Диаметр трубок 5 мм, длина 100 мм. Во всех трубках поддерживают строго горизонтальный

риод электрофореза устанавливают пробирки в штативе и заполняют их 1%- ным раствором перекиси водорода рН 7,0 (субстрат для фермента). Данную рН поддерживают с помощью буферной системы, например, приготавливают субстрат на 0,01-0,05 М фосфатном буфере рН 7,0, Использование указанного точечного значения рН диктуется

следующими условиями: использова ние раствора перекиси водорода с рН выше 7,0 не приводит к оптимальному закис- лению гелей, в то же время понижение рН вызывает ломкость геля. Процесс

ведут при комнатной температуре, высвобожденные из электрофоретических tpy6oK гели помещают в -пробирки, содержащие перекись водорода и инкубируют в течение 5 мин, после чего отделяют жидкость путем ее слива. При этом время инкубации в субстрате, а также последующие операции выдер жи- ают строго по отношению к каждому арианту. Окрашивание гелей осуществляют обычным путем, применяя 1%-ный даствор йодистого калия, подкислен- Ный разбавленной уксусной кислотой известным.способом. : При мер 2. Способ выявления Каталазной активности осуществляют ITO примеру 1, но выявляют каталазную Активность листьев яровой пшеницы.

П р И М е р 3. Способ выявления 1 аталазной активности проводят по примеру 1, но выявляют катал азную 4ктивнос ть листьев озимой пшеницы. Пример 4, Осуществление способа аналогично примерам 1-3, однако ,выявляют каталаэную активность пер- йксидазы хрена.

ПримерЗ. Способ вьшвления Иаталазной активности осуществляют rio примерам 1-4, но в отношении ката Пазы зерна яровой пшеницы.

Результаты выявления ферментативной активности согласно примерам 1-4 Схематически представлены на фиг.1. Сравнение электрофоре грамм ка- талазы печени быка, листьев яровой: И озимой пшеницы, а также пероксидаз хрена позволяет установить видовые различия по каталазной активности.

рН разделяющего геля.при

его формировании

рН разделяющего геля пос

электрофореза

рН геля после инкубации

е.го в растворе перекиси

водорода рН 7,0

рН геля после инкубации

его в растворе уксусной

кислоты . .

5

о

0

5

5

Пример 6. Способ проводят по примерам 1-5, но выявляют каталазную активность зерна озимой пшеницы.

Схема злектрофореграмм (фиг.2) представлена согласно примерам 5 и 6. Предлагаемьй способ (фиг.1 и 2) дает возможность выявить каталазную активность в различных объектах растительного и животного происхождения.

На фиг.З дана схема значений рН- системы, подготовленной к электрофорезу. По предлагаемому способу введение крахмала концентрацией меньше 0,5% в момент подготовки надсернокис™ логоаммония позволяет сохранить такую схему. Увеличение концентрации крахмала- вьш1е 0,5% приводит к экранированию пор полиакриламидного геля и уменьшению его разрешающей способности.

Надежность способа Поддерживают и предварительной обработкой геля в растворе перекиси водорода рН 7,0 и последующей инкубацией .в растворе уксусной кислоты. Формирование геля и проведение электрофореза осуществляют при различных локальных значениях рН-системы. Однако для контакта фермента с субстратом и проведения ферментативной реакции необходим оптимум рН. Поэтому инкубация геля сначала в субстрате, а затем в растворе, , содержащем уксусную кислоту, и после- д ующее окрашивание подкисленным раствором йодистого калия отвечают такому требованию. В табл. 1 представлены значения рН в процессе выявления ка талазной активности.

Т а б л и ц а 1

8,9-9,0 9,4-9,5

8,0-8,2

Нет инкубации, т.е. рН остается8,0-6,2

. 7U

При обработке геля раствором перекиси водорода, а затем уксусной кислотой в предлагаемом способе выдерживают временные режимы. Временной режим менее .чем.З мин недостаточен для пропитки геля субстратом, наблюдают эффект краевого окрашивания (как в известном способе). Увеличение времени более чем 10 мин неэко- номично, поскольку насьпцение субстратом геля происходит раньше. Кроме того, дальнейшее вьдерживание геля в растворе, содержащем уксусную кисло- ту, влияет на качество окрашивания йодистым калием, В табл. 2 представлен эффект выявления каталазной активности в соответствии с временным режимом инкубации в растворе уксусной кислоты. . . Таблида2

Активности нет 3 зоны

Четкое вьивление каталазной активности (до 4-5 зон) 3-4 зоны

Зоны размь:ты, слабая активность

5 0

5

0

5

Преимуществом предлагаемого способа является то, что он дает возможность выявлять катал азную активность в вытяжке, экстрагируемой из органов и тканей, различающихся как по происхождению, так и по функциям. Это достигается последовательным введением ингредиентов в способе, что позволяет поддерживать целостность геля, е.го высокую разрешающую способность. Способ можно применять при исследовании объектов растительного и животного происхождений. .

Фор. мула изобретения

Способ выявления каталазной активности в биологических объектах, предусматривающий формирование в каче- стве поддерживающей среды для электрофореза полиакриламидного геля с использованием крахмала, проведение щелочного электрофореза исследуемого образца, и последующее окрашивание геля йодистым калием, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, крахмал вводят в количестве, не превьппающем 0,5 мас.% на стадии подготовки раствора надсерно- кислого аммония при приготовлении разделяющего геля, а окрашивание осуществляют обработкой в 1%-ном растворе перекиси водорода рН 7,0 с последующей инкубацией в 1%-ном растворе уксусной кислоты, при этом время выдерживания в каждом из этих растворов устанавливают 3-10 мин.

.озп

0,00

-0,25

.00

Фаг. 1

ОЭП / 2 -0,00 г

0.25

PJ 8J

2