Способ количественного определения циклических нуклеотидов Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

(54) СПОСЮБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ

1

Изобретение относится к медицине и биологии и предназначено для идентификации циклических нуклеотидов в биологических жидкостях и тканях.

Известен способ количественного определения циклических нуклеотидов в бнологичаеком материале путем экстракции пробы спиртом, высушивания экстракта, раетБорёния осадка в буфере , инкубации npofet при 0°С Ё присутствии связьтающего белка и меченого нуклеотида, фильт рования, отмъгоания несвязавшейся метки с последукшим радиометрическим измерением количества циклических нуклеотидов

С1.

Однако известный способ длителен по времени анализа.

Цель изобретения- ускорение способа.

Поставленная цель достигается тем, что при осутдествлении способа количественного определения циклических нуклеотидов в биологическом материале путем экстракции пробы спиртом , высушивания экстракта, растворения осадка в буфере,

инкубации пройз при 0°С в присутствии связывающего белка и меченого нуклеотида, фильтрования, отмывания несвязавгшейся метки с последующим радиометрическим измерением количества циклических нуклеотидов, инкубацию пробы проводят непосредственно на участке милипорового фильтра, покрытого гидрофобным материалом.

Способ осуществляется следующим об10разом.

Пример. Определение содержания циклического З 5-аденозинмонофосфата (цАМФ) в ткани

15 скелетных мышц больного миопатией Дкшена.

Биоптат мышечной ткани немедленно погружают в жидкий азот, затем гомоге20низируют в 3-5 мл кипящего этанола, центрифугируют при 5 000 об/мин 15 мин, упариваюпр досуха при 4О°С. Осадок растворяют.в 0,5 мл буфера, содержашего 5 KtM; трис- нее, 0,4 MAI ЭДТА, рН 7,4. 15 мкл исследуемого образца переносят на гидрофобное покрытие милипорового фильтра, добавляют 15 мкл Н цАМФ и 30 мкл цАМФ-связьтакяцего белка. Инкубируют ЗО-45 мин при ОС. Затем фильтры промьта1ст хододным буферным раствором, содержащим 5 мМ и 0,5 мМ ЭДТА рН 7,4; высушивают, помещают в толуольный сцинтил- ю лятор и измерякгг уровень радиоактивности на сцинтилляютонном счетчике. В таблице приведен расчет содержания ц/АМФ. Содержание цАМФ в образце опреде- и лякл- по формуле( 11 К. Коэффициент К (тангенс угла наклона) 8 3-1 Сл. содержание цАМФ:

/110S . 41504 2,96. В пересчете на мг белка, содержащегося в пробе, концентрация цАМФ составила 3,52 пкмоль. При определении концентрации цАМФ известным способом рас четы проводятся аналогично и Содержание нуклеотида в данном образце составило 3,7 пкмоль/мг белка. П р п м е р 2. Определение содержания циклического 3 5 гуанозинмонофосфата (цГМФ) в ткани скелетных мьшш бального боковым амиогрофичес ким склерозом. Экстракцию цГМФ проводят так же как цАМФ, Затем 30 мкл исследуемого офазца переносят на гидроф,бное покрытие милшторового фильтра, добавляют 15 мкл Н цГМФ и 15 мкл антисыворотки. Каплю инкубируют ЗО-45 мин при О-2°С Дальнейшие операции аналогичны проводимым при определении пАМФ. Содержание нуклеотида рассчитывают стандартным методом. Концентрация цГМФ, ютределенная известным способом, составила 1,56 пкмоль/мг белка, а предлагаемым способом 1,61 пкмоль/мг белка. по ши и 5 в вр оп Использование предлагаемого способа зволяет без снижения точности уменьть количество используемых реактивов тем самым снизить стоимость анализа 3-4 раза. Одновременно сокращается емя проведения анализа и трудоемкость ераций. Формула изобретен И:: Способ количественного определения циклических нуклеотидов в биологическом материале путем экстракции пробы спиртом, высушивания экстракта, растворения осадка в буфере, инкубации пробы при 0°С в присутствии связывающего белка и меченого нуклеотида, фильтрования, отмьшания несвязавшейся метки с последующим радиометрическим измере.гнием количества циклических нуклеотидов, отличающийся тем, п-о, с цеЛью ускорения способа, инкубацию пробы проводят непосредственно на участке милипорового фильтра, покрытого гидрофобным материалом. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Бадденков Г.Н. Изучение механизмов регуляции активности аденилатциклазы гормонами.,Канд. дис. М., МГУ, 1979.