Способ получения -гомосерина Советский патент 1981 года по МПК C12P13/06 

{

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения Ь-гомосерина, явЛ5пощегося промежуточным продуктом биосинтеза метионина, треонина и изолейцина во всех живых организмах и используемого в парфюмерной промышленности в качестве важного компонента косметических кремов ОЛЯ увлажнения кожи.

Известен способ -получения L -гомосерина с использованием треонинзависимого мутанта h d ocarЪoc6cJst 1)$ утилизирующего углеводороды С - С в присутствии необходимых ростовых факторов (треонин, биотин, тиамин) и солей (фосфора, магния, микроэлементов). В культуральний жидкости накапливается до 6,5 г/л гомосерина l .

Недостаток указанноги микробиологического способа получения Ь -гомосерина заключается в том, что при осуществлени его микроорганизмы вьфашивают на питательных средах с чистыми сахарами (глюкоза, мальтоза), а в качестве источника ростовых факторов испсшьзуют либо чистые аминокислоты (треонин) и витамины (биотин, тиамин), либо содержащие их дорогостоящие и дефицитньте препараты, например экстракт печени.

Известен также способ получения U гомосерина путем глубинного культивирс вагшя продуцирующих его треонинзависимых микроорганизмов вида BrevitoCteHuwi Ес«ии1или Cc«r: «et)acteHuni ybutatflicum в условиях аэрации на питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, минеральный азот и другие необходимые соли в присутствии источника ростовых веществ. Используемые щтам мы по этому способу выращивают в колбах на качалке на питательней среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или мальтозу, а в качестве источников ростовых факторов - экстракт печени, . -амннили чистые аминокислоты (треонин) и витамины (биотин). Па синтетической питательной, среде с чистыми препаратами треонина и биотина мак38симальиый уровень накопления гомосерина составляет - 12,4 г/л, на полусиНтетической (с применением экстракта печени и NZ -амина) - 7,3 г/л. Полученный гомосерин выделяют с помощью ионообменных смол. Выход проаукта составляет 61 % 2j. Недостатком способа является использование в.качестве источников углерода чистых углеводш (глюкоза мальтоза), а в качестве источника ростовых факторов - дорогостоящих комплексных препар тов NZ-амина (фирменный препарат) и . экстракта печени. Цель изобретения - повышение рыхода Z-гомосерина. Поставленная цель достигается теМ; что в качестве треонинзависимых микро- организмов - пропуцентов из видаБУбУ boct-eriuvniCavuwi используют штампBi evibacteriurv fBavuwi В-1О06, или из видаСоп- пеЪасЬеучиуи «yCutaw-ik.um штамм Сог5 пеЪас-ьег1ип Cutctm-iltum вНИИгенетика 49-7, При этом культивирование вепут на пйтате ьной среде, содержащей в качестве ассимилир;55 емых источников углерода мелассу, гипрол, сахар, ацетат или уксус ную Кислоту, а Б качестве источника рос 7 товых веществ используют кукурузный экстракт или гидропиааты растительного, животного или микробного белка, или авто- лизаты или гидролизаты дрожжей. В качестве штаммов-продуцентов применяются треонинзависимые мутанты ВлгiBavuwi В-10О6 и Cor-g-eutawcuw ВНИИгенетика 49-7, В отличие от извест ных продуцентов предтагаемые культуры характеризуются способносты 5 накапливать на синтетической среде до2О-21г/д L -гомосерина. Культуры хранятся в музее промышленных культур микроорганизмов ВНИИгенетика и имеют регистрационный номер. 1006 и 1505, соответственно. Мутант Br.f Вшит В-1О06 получен из штамма такого типа B -feqvun)ATCC 14О67 в результате комбинированного ES03действия двух мутагенов - Уф лучей и этиленимина (ЭЙ), мутант CongCutamicuvM ВНИИгенетик-а 49-7 - из штамма дикого типа Сог. g ButaMiicuniATCC 13032 в результате воздействия химического мутагена - нитрозогуанидина. Культурально-морфологическая харак еристика штаммов-продуцентов Ь -гомосерина приведена, в таблице.

Штамм

BrevitecteHuvYi 8avuwi

Характеристика В-1О06

Клетки овальные, длиной 1,52,5 мк, бесспоровые, неподвижные, грамположительные,

А) На пятые сутки роста при колонии диаметром 4 - 5 мм, круглые с гладким краем, центр приподнят в виде корпуса, поверхность гладкая, блестящая, цвет Желтовато-кремовый, На вторые сутки рост штриха умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, плотная.

Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности ере ды.

CxsrvnebacteHuvM g Buiurnicuwt

ВНИИгенетика 49-7

Клетки овальные, длиной 1,0-2,0 мк, бесспоровые, грамположительные, неподвижные. .

На пятые сутки роста при 28 С

колонии диаметром 3-4 см, К|эуглыё с гладкими краем, центр приподнят, по «раю концентрическая складка, поверхность гладкая, блестящая, цвет кремовый.

На вторые сутки рост штриха yMepeitный, поверхность блестящая, плотная.

Рост по укочу умеренный, в основном на поверхности среды.

Штамм

BrevibacteriuYM itavum

Характе ристика

V

инеральная

Для роста необходим биотин, реда Гловера тиамин, и треонин. На пятые с глюкозой сутки роста колонии диамет- ром 2,0-2,5 мм светлокремового цвета. Рост штриха на 3-е сутвд умеренный, плотный.

изиол огичесТемпература: растут при 2О37 с, оптимум 28-ЗОс, ие свойства рН: растет при 6 - 9, оптимум 7,0-8,0. Углеводы: хорошо утилизируют Глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, хуже галактозу, не используют лактозу, не гипролизуют крахмал. Спирты: использ)тот этанол, инозит, используют, но не утилизируют сорбит, маннит, оульцит, глицерин.

С ганические кислоты: хорошо используют уксусную кислоту, хуже молочную.

Источники азота: хорошо усваивают аммонийный азот (МНДСе (N«4 )2504 мочевину, и т.о.) не усваивают нитратный азот. Обладают уреазной активностью. Жела-тину не разжижают. Для осуществления процесса биосинтеза гомосерина культуру микроорганизма выращивают на агариз1жашсой питательной среде Хоттингера в течение ОЕЩОЙ сутки при 28-30 С. Затем суспензию клеток передают в колбы с посевной средой, сооержащей мелассу 4%, кукурузный экстрак 3% и NoiCC 0,4%, и проводят вырашивание на качалках (22О об/мин) в течение су ток. Выросший посевной материал передают в количестве 3-10% в основную ферментационную срецу. Процесс ферментации осу1дествляют либо в колбах на качалке, либо в ферментере, объемом О,5- ЮО.ОО тыс.л. при интенсивном перемешиПродолжение таблицы

, Oor helDcic teHum QfCutawicum ВНИИгенетика 49-7

Для роста необхопим биотин и треонин. На пятые сутки колонии диаметром 1,О-2,О мм светло-кремового цвета. Рост штриха на вторые сутки умеренный, плотный.

Температура: растут при 2О-37 С, оптимум 28-30 С, рН: растет при б - О, оптимум 7,О-8,О. Углеводы: хорошо утилизируют глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, хуже галактозу. Ксилозу, мэннозу, не используют лактозу, не гиоролнзуют крахмал .

Спирты: слабо утилизируют этанол, не используют глицерин, дульцит, маннит.

Органические кислоты: хорошо используют уксусную и молочную кислоты, хуже фумаровую, янтарную, пировиноградную.

Источники азота: хорошо усваивают аммонийный азот, мочевину, не усваивают нитратный азот. Обладает уреазной активностью. Желатину не разжижают. вашга и аэ{эации в течение 6О-72 ч, при 24-32 0, рН 6,5-7,7 на питательной среоЁ, сооержашей источники углерода, например сахарозу, глюкозу, мелассу и гидрол, источники минеральвого. азота, , например соли аммония, хлористого , сернокислого, азогйокислого и др., мочевину соли фосфора, например фосфаты калия, аммония, и пр., соли магния, например сульфаты, хлсфиды и пр., источники рос товых факторе, например гидролизаты, кислотные или ферментативные микробного (собственная биомасса) Или дрожжевого белка, пилучеиного на углеводородах нефти БВК или древесных гицролизатах.

гиоролизаты лакгоальбумина арахисового.) соевого, подсолнечного или соевого шротов

автолизаты дрожжей ( или кормовых), кукурузный экстракт и т.д., а также чистые препараты L -треонина, . d -биогина (или оестиобиотина) и тиамин

Через 6О-72 ч ферментации культуральная жидкость содержит, г/л: L-гомосерин 6-20; L-лизин 5-11; аланин 1,5, L-глутаминовая кислота 0,2-5,3, валив 0,9-1,2.

Гомосерин можно выоелить в виде кристаллов или получить в виде технического препарата, представляющего собой концентрат (жидкий или сухой), получавмый упариванием культуральной жидкости совместно с биомассой. Технический П1эепарат L-roMocepHHi получают в виде порошка без напол11ителя (гигроскопическая форма), либо с наполнителем, напри- мер пшеничными отрубями или Са(ОН) (негигроскопичная форма).

Для стабилизации гомосерига в культур альную жиокость в конце процесса добавляют нес или HjSCi до рН 1,52,0, или бисульфит натрия 0,3%,. хлороформ 0,3-1,О% и другие антисептики.

П р и м ёр 1 ,Односуточную культуру BreV.itavuwi В-1006, выращенную на косяках с агаром Хоттингера, пересеивают на жидкую питательную среду, имеющую состав,%:

Меласса4,0

Кукурузный

экстракт2,0

NaCt0,4

Выращиваш1е посевного материала проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (объем среды 30 мл) на качалке (200-220 об/мин) при 20±1°С и пепередают в количестве 5% в ферментационую среду Следующего состава,%:

Глюкоза15,О

(,5

.-7H200,О4

КИдРО 0.3

.Feso -TH o0,001

Ми 504-74,00,001

Треонин0,03

СаСОз5,0

БИОТИН1,2 .

Тиамин2О

Ферментацию осуществл5пот в колЬах Эрлейнмейергз объемом 750 мл (объем среды 25 мл) на качалке (220 об/мин) при в течение 66-72 ч. В конце ферментации культуральная жидкость содержит, гл: Ь-гомосерин 12,6 и L -лизин 5,2,

Из культуральной жидкости L- гомо,серин можно выделить известным способом в виде кристаллов.

П р и м е р 2 . Культура, способ приготовления посевного материала и условия основной ферментации, как в примере 1. Отличием является состав ферментационной среды, содержащей следующие компоненты,%:

Сахар технический. 15,0

Автолизат ВВК (аминный азот

О,В%)1,5

(NH4)i5043,0

К2.ЦРР41,15

/WgrBO -THjO0,06

,0

Через 72 ч выращивания в культураль ной жидкости накапливается г/щ: L-гомсерин 13,3, L-лизкН 6,3 и аланин 1,3

П р и м е р 3 . Культуру . ЕаVUVW В-1ОО6 выращивают на посевной среде согласно примеру 1. Биосинтез гомосерина осуществляют в колбах Эр- лейнмейера объемом 25О мл (объем среды - 12 мл) на качалке (220 об/мин при 29:+1с в течение Зсут. на питательной среде следующего состава,%:

Меласса

20

Нд)2504

2,6

КзНРО

0,2

0,05

СаСО,,

ЗО

Гидролизат

БВК(сернокислый)

0,75(на технически вес БВК).

Через 72 ч выращивания в культуралной жидкости накапливается г/л,: U -гомосерин 12,5 L-лизин 8,2 и аланин 0,8

П р и м е р 4 . Ферментацию проводят по примеру 3. Отличием является состав ферментационной среды. В качестве источника ростовых факторов испильзу ют кислотный Гидролизат хлопкового шрота в количестве .

Через 70 ч вьфащивания продуцента в культуральной жидкости накапливается г/л,: L-гомосерин 9,8 и I,-лизин 8,5.

П р и м е р 5 . Односуточную культуру Cor.grEutamiCum ВНИИгенетика 49-7 выращивают на посевной среде по примеру 1. Основную ферментацию осуществляют на питательной среде слеаун щего состава, %: Меласса Кукурузный 2,0 (по экстракт техническо му весу) (N«4)2604 2,5 СаСО 2,0 Режим культивирования по примеру Через 72 ч выращивания продуцента в культуральной жиокости содержится, г/л L - гомосерин 9,4/ L -лизин 6,2; L -глут миновая кислота 2,3 и1;аланин 3,0. П р и м е р 6 . Культура и способ приготовления посевного материала как § примере 1. Основную ферментацию проводят в ферментаторах (емкость 0,5 л) при интенсивном перемешивании (мешалка 60О-800 об/мин) и аэрировании (GJ 1: об/мин) при 29tl,cf С в течение 72 ч на питательной среае,%: Меласса17,О CNH4)2S042,5 КпНРО.0,15 Mg-504-7H2O0,05 Ферментолизат БВК (аминный азот1,8%)2,2 CaCOj3,0 В конце ферментации через 96 ч культуральная жидкость содержит, г/п: U- гомосерин 8,3 и Ь-лизин 9,3, Полученную культуральную жидкость пос ле добавления 0,3% бисульфита натрия (по массе) в виде кристаллов или водно го раствора упаривают под вакуумом (о таточное давление О,07-О,2 ат) до 25-55%-ного содержания (по массе) сухих веществ при минимат.но-возможн тепловом возсействии (до 15 мин), например в проточно-пленочном испарител или в аппарате с падающей пленкой жид кости. В готовом продукте содержится Ь -гомосерина - 15-25 г/л. П р и м е р 7 . Культура Вг- f ta В-1006. Выращивание посевног материала осуществл5п6т в две ступени. На первой ступени пи примеру 1, На второй ступени - посевной материал выращивают в ферментах емкостью Ю в течение 16-22 ч на питательной сре с мелассой (4%), кукурузным экстракто (3%) и (0,4%), используя для засева посевной материал из маточных колб в количестве 0,01-0,001% (по объему). Для засева ферментационной среды используют посевной материал пто рой ступени, передавая его в количестве 2-1О% (по объему). Основную ферментацию гомосерина осуществляют в рабочих ферментах емкостью 10О м на ферментационной среде следующего состава, %: Меласса17,О Кукурузный экстракт3,0 (МНд)2 Р04О Mg-S04-7H{tO0,05 Ферментацию проводят при при аэрации 0,5-1,0 объем возЦуха на I объем среды в 1 мин при постоянно работающей мещалке, имеющей 180об/ми1Г. рН в ходе процесса подиерживают на уровне 6,8-7,7 добавлением соответствующего реагента ( или НС1). Через 68 ч культивирования в культуральной жидкости накапливается, г/л: L-Гомосерин 10,3 и Ь -лизин 8,3. Полученную культуральную жидкость упаривают по примеру 5 и высушивают на распылительной сушилке, преиварител -. но доведя.рН концентрата до 11,5-12,0, например добавлением измельченной Са(ОН)2 (10-30% извести от массы веществ ксшцентрата) при температуре теплоносителя на вхосе 170-35О С и на выходе 8О-120 С, Полученный концентрат представляет собой воздушносухой псрошок, содержащий 4% гомосерина, 3% лизина, О,05-О,8% валина и 0,5-1,5% аланина. П р и м е р 8 . Культуру Bt-f aVUW В-1ОО6 вьфшцивают на посевной среде по примеру I и передают в количестве 5% (по объему) в ферментационную среду следующего состава,%: Ацетат N«4Pt8 Глюкоза2,0 К2 ЦР040,2 THsfO0,5 Автолизат БВК (аминный азот 1,О%)2,5 Ферментацию проводят в ферментерах емкостью 0,5 л, оборудованных системой терморегуляции, датчиками измерения рО и рН , а также устройством, обес.печивающим автоматическое подоержание рМ на заданном урсдане. Ферментацию проводят щ)и постоянно работающей мещалко (80О об/мин) в постоянно подаваемом через барбатер ,-воздуха (1;1 об/мин). рН среды перед началом процесса 6,56,8, Через 6-8 ч ферментации после достижения уровня рН 7,4-7,6 включает;СЯ подача подпитки, осуществляемая автоматически по сигналу рН-цатчика. Состав используемой подпиткиД: Ацетат13,5 Ацетат46,5 Через 72 ч ферментации расходуется 118 мл подпитки. В культуральчой жис кости накапливается 12,6 г/л Ь -гомойерииа и 11,5 г/л Ь-лизина. Таким образом, как показано в примеpax, предлагаемый способ позволяет получить Ь -гомосерин как на синтетических, так и на комплексных питательных средах, т.е. на средах, содержащих раз личные щеточники углерода и доступное и дешевое техническое сырье. Предлагаемые новые штaммь -пpoдyцeнты гомосерина синтезировать до 20 г/л продукта. Способ рекомеидован к внедрению на предприятиях микробиологической промыш лвнности для производства Ь-гомосерина в кристаллической форме или в форме технического препара:та (концентрата). Формула изобретения 1. Способ получения Ь -гомосерина путем глубинного культивирования проду цирующих его треонинзависимых микро- . организмов видaБi viЪacte iuщ iEovum или CorvnebacteHum g tutamicum 64 7.12 в услови$1х: аэрации на питательной среце, содержащей ассимилируемые источники углерода, минеральный азот и другие необходимые соли в присутствии источНИКОВ ростовых веществ., отличающийся тем, что, с целью повышения выхода U-гомосерина, в качестве треонин зависимых микроорганизмов- продуцентов из видaS 6viЪacteHulт ftovum используют штамм B evilaac-teHuw fbdvuni В-1006, или из видаCoi webacteHuVn gtutct л-icum штаимл CorvnebactftHum gtotxjmicum ВНИИгенетика 49-7. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве ассимилируемых источников углерода мелассу, ги1фол, сахар, ацетат или уксусную KiicnoTy, а г качестве источника ростовых веществ используют куку рузныйэкстракт или гидролизаты растительного, животного или микробного белка, или автолизаты ил1 гидролизаты дрожжей. Источники инфо,эмации, принятые во внимание при экспертизе 1.Патент Франции № 1581254, кл. С 12 D , опублик. 1965. 2.Патент Франции № 13О6О15 кл. С 12 ТЭ , опублик. 1965.