Способ получения тимозина из тимусов млекопитающих Советский патент 1986 года по МПК A61K35/55 A61K35/00 

11

Изобретение относится к медицине, в частности к получению гормонального фактора тимуса.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и упрощение спо соба путём использования определенного режима клеток и приемов очистки.

Пример 1. Получение сырца тимозина.

500 г слегка дефростированных же- лез (тимуса телят) измельчают на мясорубке. Измельченный тимус порциями гомогенизируют в размельчителе

тканей РТ-1, добавляя частями (1,5 л 0,15 М раствора хлористого натрия. Каждую порцию гомогенизируют в течение 3 мин. Полученный гомогенат перемешивают в течение 1 ч с помощью ме- ханическор мешалки при 8-10 С скорость перемешивания 500 об/мин . По окончании экстракции жмых отделяют центрифугированием при 2500-3000 об/ мин в течении 30 мин при А С. Суперна тант нагревают в водяной бане с температурой до в течение 15 мин. Горячую смесь охлаждают в бане со льдом, осадок термолабильных белков отделяют центрифугированием при 2500-3000 об/мин в течение 30 мин при 4°С, а супернатант фильтруют через асбесто-целлюлозную пластину типа ЕКС.

Прозрачный, охлажденный экстракт (1,24 л) вливают при постоянном перемешивании в 5 объемов .(6,2 л) хо- , лодного (-10°С) ацетона, помещенного в фарфоровую емкость и оставляют в холодильнике.

Через 12-16 ч надосадочный раствор сифонируют. Осадок высушивают на воронке Бюхнера, промывая 3-4 раза аце- тоном (около 1 л). Высушенный порошок тщательно растирают в течение 2-3 ч, сушат на воздухе до полного удаления ацетона. Получают 9,0 г сырца тимозина.

Получение субстанции тимозина.

1) Солевое фракционирование.

Полученный сырец растворяют в 0,01 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0 в соотношении 1:10 - 9,0 г сырца в 90 мл буфера - и в течение 30 мин перемешивают на магнитной мешалке при комнатной Температуре.

Полученный раствор центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин и 4 С.

К супернатанту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония из рас

5 0 5 0

5

5

362

чета 3 объема супернатанта и 1 объем насьш1енного раствора, в котором предварительно установлен рН 7,0 с помощью водного раствора аммиака. Смесь перемешивают при 6-8 С в течение 1 ч. Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин при 4°С.

Затем в супернатанте устанавливают рН 4,0-4,05 с помощью 10%-ного раствора уксусной кислоты. В полученный раствор добавляют 15,8 г сульфата аммония из расчета 14,6 г сульфата аммония на 100 мл раствора. Смесь перемешивают в течение 1 ч при 6-8°С и оставляют в холодильнике на ночь (18-20 ч). Осадок отделяют центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин и 4 С.

2) Обессоливание и лиофильное высушивание .

Влажный осадок растворяют в 90 мл 0,01 М трис -НС1 буфере (рН 8,0) в течение 30 мин, перемешивая на магнитной мешалке при 6-8°С, нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием при 3000 об/мин и 4°С. Раствор наносят на колонку (50«1000 мм), заполненную сефадексом Г-25 и элюируют 0,05 М раствором бикарбоната аммония со скоростью 100 мл/ч. Фракции, соответствующие первому пику поглощения, объединяют и лиофильно высушивают Получают 0,65 г тимозина.

Выход тимозина из тимуса телят составляет 1,3 г из 1 кг железы.

Пример 2. Аналогично примеру 1. Экстракцию проводят 1,5 ч.

Выход тимозина 1,35 г из 1 кг железы.

Пример 3. Аналогично примеру 1. Экстракт после отделения жмыха термостатируют 20 мин. Выход тимозина 1,35 г из 1 кг железы.

Пример 4. Аналогично примеру 1. Химозин получают из свежезамороженных вилочковых желез ягнят. Выход тимозина 1,4 г.

Пример 5. Аналогично примеру 8. Тимозин получают из вилочковых желез тюленей. Выход тимозина 1,2 г из 1 кг железы.

Пример 6. Аналогично примеру 1 . Экстракт перемешивают со скоростью 2000 об/мин. Выход тимозина 1,35 г из 1 кг железы.

Положительный эффект заключается в повышении выхода целевого продукта Б 5-6 раз.