Способ выделения полинуклеотидфосфорилазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/14 C12R1/19 

4j

9 4i

СД

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам получения высокоочищенных ферментов, и может быть использовано для выделения и очистки полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы) с последующим применением фермента для синтеза высокомолекулярных гомои гетерополирибонуклеотидов и ряда других биохимических исследований, Полинуклеотидфосфорилаза является ключевым звеном работ по получению двухспиральных комплексов полирибонуклеотидов, являющихся наиболее эффективными невирусными индукторами .интерферона.

Известен ряд способов получения высокоочищенной полинуклеотидфосфорилазы, пригодной для иммобилизации и синтеза высокомолекулярных полирибонуклеотидов. Большинство этих способов основано на -использовании хроматографии на ионообменных сорбентах, гель-фильтрации, солевого фракционирования .белков, высокоскоростного центрифугирования и незначительно различаются между собой. Известен спосрб выделения полинуклеотидфосфорилазы, включающий следующие последовательные стадии: получение грубого экстракта биомассы Escherichia coli В., денатурацию примесных белков пр эгреванием экстракта, удаление нуклеоновых кислот фракционированием на ДЭАЭ-целлюлозе, концентрирование белка сульфатом аммония, фракционирование фермента сульфатом аммония, удаление сульфата аммония диализом, хроматографию фермента на ДЭАЭ-сефадексе А-50, концентрирование фермента сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексе Г-200,. концентрирование ультра- . фильтрацией на фильтрах ХМ-50 ij .

Данный способ дает очистку в 210280 раз. Основным недостатком способа является многостадийность и длительность процесса очистки.

Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения полинуклеотидфосфорилазы из Escherichia coli, включающий разрушение клеток путем растирания с окисью алюминия с последующей обработкой дезоксирибонуклеазой, отделение бесклеточно-. го экстракта, высокоскоростное центрифугирование при 100000 д, фракционирование его хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе,, концентрирование фермента в элюате суЛьфатом аммония, фракционирование белков сульфатом аммония, диализ, сорбцию фермента на диэтиламиноэтилсефадексе А-50 при рН 7,5 в градиенте NaCI с последующей элюацией, концентрирование сульфатом аммония и 5 гель-фильтрацией, после чего проводят концентрирование ультрафиЛьтрацией и аффинную хроматографию на голубой декстран-сефарозе в градиенте концентрации КСС (0-1,0 М) или поли

0 (И) (0,1 МКМ) 2 .

Указанный способ является многостадийным и .трудоемким. Кроме того, недостатком является использование аффинной хроматографии фермента, уже

5 имеющего высокую степень чистоты (удельная активность ПНФазы 700 ед.акт./мг). Это не позволяет реализовать преимущества метода аффинной хроматографии для очистки

0 фермента. Кроме того, голубая декстт ран-сефароза и BrCN-сефароза, используемая для получения, аффинного сорбента являются труднодоступными импортными реактивами, а использова5 ние полиинозиновой кислоты для элюции фермента с голубой декстран-сефарозы требует проведения дополнительных стадий очистки фермента от полинуклеотида, который загрязняет препараты.

Цель изобретения - .упрощение способа получения полинуклеотидфосфорилазы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения полинуклеотидфосфорилазы из Escherichia

coli, включакяцему разру1 ение клеток в присутствии дезоксирибонуклеазы, отделение бесклеточного экстракта, хроматографию его на диэтиламиноэтил0 целлюлозе, концентрирование фермента в полученном элюате сульфатом аммония и сорбцию полинуклеотидфосфорилазы на сорбенте с последующей элюцией, повторным концентрированием фер5 мента в элюате с помощье сульфата аммония и гельфильтрацией, в качестве сорбента используют альдегидосилохром, ковалентно связанный с лигандом - красителем процион ярко-гоQ лубой M-R, причем сорбцию фермента ведут в среде буфера рН 8,9-9,1, содержащего 0,9-1,1 М КСЕ и 5-15 мМ MgCl2 , а элюцию осуществляют бессолевым буфером рН 8,9-9,1.

Обычно разрушение клеток проводят

лизоцимом в присутствии Тритона Х-100,

Используемый в качестве сорбента процион-силохром имеет формулу

и содержит в качестве лиганда ковалентно связанный с альдегидосилохромом остаток красителяпроциона яркоголубого М-Я структурного аналога цибакрона ЗС - А, Связь между красителем и матрицей осус;ествляется через 3,3-диаминобензидиновый мости Использование в качестве аффинного сорбента процион-силохрома позволяе проводить сорбцию полинуклеотидфосфорилазы в присутствии 0,9-1,1 М кеб и 5-15 мМ при рН 8,9-9,1, а элюцию вести.при том же рН в отсутствии КС6 и MgCBj . В этих условиях отделение основной части балластных белков происходит, уже при нанесении образца на аффинный сорбент. Выбранные условия хроматографии на аффинном сорбенте значительно сокращают время ее проведения и упрощают аппаратурное оформление стадии.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки Е. coli МРЕ-бОО разрушают лизоцимом в присутствии Тритона Х-100 и панкреатической ДНКазы, необходимой для гидролиза освобождающейся ДНК и, как следствие, для уменьшения вязкости раствора, что облегчает дальнейшее проведение очистки. Полученный грубый экстракт наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозо и элюируют фермент 0,15 М КС. Из фракции, содержащих фермент, осаждают белок добавлением сухого сульфата аммония до степени повышения 0,6-0,8. После растворения фермент наносят на колонку с процион- силохромом в-присутствии 0,9-1,1 М КС и 5-15 мМ что обеспечивает удаление балластных белков. Элюцию фермента осуществляют при рН 8,99,1 бессолевым буфером, содержащим 50 мМ трис-НСе; 0,5 мМ ЭДТА; 0,2 мМ ДТЭ; 5%- глицерина.

После элюции фермента его можно концентрировать сульфатом аммония и фракционировать на биогеле А 1,5 М. Фермент, полученный на этой стадии, может быть использован для синтеза полирибонуклеотидов без дополнительной обработки.

Получаемый по предлагаемому способу фермент имеет 240-кратную и удельную .активность 470 ед. акт./мг. Фермент электрофоретически гомогенен.

Пример 1. Получение аффинного сорбента.

Для получения аффинного сорбента используют альдегидосилохром, синтезированный по методу S , с использованием широкопористого силохрома С-1.

Суспензию 1 г альдегидосилохрома в 7-10 мл обрабатывают 20 мкмол 3, 3-диаминобензидина при 80-90С в

течение 30 мин. После охлаждения суспензии и отмывки, водой добавляют 20 мкмоль проциона ярко-голубого M-R и выдерживают смесь в течение 30 мин, затем добавляют NajCO до конечной концентрации 20. мг/мл и вы-, держивают 30 мин при . Полученный сорбент помещают в хроматографическую колонку ипромывают формамидом,12 М КСЕ и водой до отсутствия

0 оптической плотности на выходе с колонки-.

Пример 2. Выделение и очистка полинуклеотидфосфорилазы,.

Получение голубого экстракта.

К суспензии 25 г биомассы E.coli

5 МРЕ-600 в 75 мл. 50 мМ трис-НСЕ (рН 8,0), 10 мМ МдСЕг I 0,5 мМ ЭДТА, 0,2 мм ДТЭ, 5% глицерина (буфер ТМЭ) добавляют 20 мг лизоцима (марка Б, Олайне) и инкубируют на ледяной ба0не в течение 15 мин. После добавления 0,1 мл Тритона Х-100 и дополнительной инкубации в течение 30 мин добавляют 25 мкл панкреатической ДНКазы (10 мг/мл) и инкубируют еще

5 30 мин. После центрифугирования при в течение 60 мин при 5000 об/мин осадок отбрасывают, а суспернатант (грубый экстракт) используют для выделения фермента.

0

Фракционирование на ДЭАЭ-целлюлозе.

Грубый экстракт наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (Олайне) объемом V170 мл, уравновешен ную ТМЭ-буферой, рН 8,0 со Скоростью 50 мл/ч. После нанесения колонку промывают тем же буфером до отсутствия оптической плотности в элюате. Фермент с колонки элюируют 0,15 М КСР в ТМЭ-буфере при рН 8,0. К полученному элюату ( мл) добавляют сухой (NH4)2 SOi} Д° степени насыщения 0,6. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин.

Фракционирование на процион-силохроме.

Осадок белков растворяют в ТМЭбуфере (рИ 9,0), содер1:-ащем 1 М КСР, полученный раствор наносят на колонку с аффинным сорбентом объемом 20 мл со скоростью 40 мл/ч. После нанесения колонку промывают, тем же буфером до отсутствия оптической плотности в элюате. ПНФазу элюируют бессолевым буфером, содержащим 50 мМ трис-НСР (рН 9,0), 0,5 мМ ЭДТА, 0,2 мМ ДТЭ, 5% глицерина. Фракции, содержащие фермент, объединяют и концентрируют ПОЛИНуклеотидфосфорилазу добавлением сухого (NH)2 504 до степени насыщения 0,6.

На этой стадии дос;тигается значительная очистка фермента из практически нефракционированного грубого экстракта - не менее чем в 14 раз.

Фракционирование на биогеле А 1,5 М.

Осадок фермента растворяют в 0,5 мл ТМЭ-буфера (рН 8,0) и наносят полученный раствор на колонку с биогелем А 1,5 М (15 мл). Фракции, содерхсащие фермент, объединяют и до использования хранят при без какой-либо дополнительной обработки.

На стадии достигается дополнительная очистка фермента (до 6 раз) и перевод в буфер необходимого состава.

Полученный по предлагаемсжу спо.собу фермент при электрофорезе 5 мкг в денатурируннцих условиях гомогенен, имеет удельную активность 470 ед, акт,/мг при степени очистки 240.

Активность фермента на всех стадиях определяют по включению (С ) АМФ в кислотонерастворимый продукт. Реакцию проводят при в присутствии 25 мм АДФ, 10 ММ Mgcejl мМ ЭДТ 0,15 М трис-НСС (рН 8,0). За единицу активности принимают количествофермента, катализирующее включение 1 мкмоль АМФ .в полимер в течение 1ч в выбранных условиях.

Использование предлагаемого способа очистки полинуклеотидфосфорилазы по сравнению с известным позволяет упростить процесс очистки ПНФазы путем сокращения количества стадий с одиннадцати до шести и использования более технологического метода разрушения биомассы по сравнению с растиранием с hl При этом исклчаются нетехнологические стадии высокоскоростного ультрацентрифугирования, ультрафильтрации и диализа и малоэффективная стадия фракционирования сульфатом аммония, а также стадий хроматографического разделения белков с применением градиентного элюирования. Кроме того, процесс упрседается за счет применения стадии аффинной хроматографии для очистки ПНФазы из практически нефракционированного (по белку) грубого экстракта клеток и многократного использования аффинного сорбента.

1. СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗЫ из Escherichia coli,включающий разрушение клеток в присутствии дезоксирибонуклеазы. .ft-t. I и и ,: iiHlkJtttOTKK отделение бесклеточного экстракта, хроматографию его на диэтиламиноэтил целлюлозе, концентрирование фермента в полученном элюате сульфатом аммония и сорбцию полинуклеотидФосфорилазы на сорбенте с последующей элюцией, повторным концентрированием фермента в элюате с помощью сульфата аммония и гельфильтрацией, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве сорбента используют альдегидосилохром, ковсшентно связанный с лигандом красителем процион ярко-голубой М- , причем сорбцию-фермента ведут в среде буфера рН 8,9-9,1, содержащего 0,9-1,1 М КСЕ и 5-15 мМ Mgce , а элюцию осуществляют бессолевым бу(Л фером рН в,9-9,1. 2. Способ по п. 1, отличающий с я . тем, что разрушение клеток проводят лизоцимом в присутствии Тритона Х-100.