Способ очистки микробной трипсино-пОдОбНОй пРОТЕиНАзы Советский патент 1981 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к способам производства ферментных препаратов микробного происхождения, в частности к получению заменителей животного трипсина.

Известен способ очистки микробной трипсиноподоонои протеиназы 1, полученной из культуральной жидкости путем осаждения сульфатом аммония при 0,5 насыщения и фракционного осаждения ацетоном, который включает следующие стадии.

Ионообменная хроматография этого препарата на КМ-целлюлозе в 0,оМ. фосфатном буфере рН 6,0. Для вымывания белков из КОЛОНКИ была применена ступенчатая элюдия следующими концентрациями NaCl в исходном буфере: 0,ОЗМ; U,06M и 0,1М.

Гельфильтрация на сефадексе 1-75 фракции IV, полученной при хроматографии на КМ-целлюлозе, которая ооладала высокой трипсиновой активностью, с целью дальнейщей очистки. Полученный фермент обладает рН-стабильностью в интервале рН от 4,0 до 9,0 и сохраняет лищь 9% активности при iO-минутном нагревании до 60°С.

Таким образом известный способ не позволяет получить фермент, обладающий достаточной термостабильностью и устойчивостью при низких значениях рН.

Целью изобретения являетсй расщирение сырьевой базы и получение фермента, обладающего повышенной термостабильностью и стабильностью в кислой среде.

Поставленная цель достигается тем, что в известном спосоое очистки микрооной трипсиноподобной протеиназы в качестве микрооной протеиназы используют протофрадин, осуществляют хроматографирование ее на ДЭАЭ-целлюлозе и после гельфильтрации на акрилексе повторно хроматографируют на КМ-целлюлозе и сефадексе.

Сущность способа заключается в следуюЩем.

Для очистки целевого фермента предусматривается проведение следующих стадий: фильтрование через ДЭАЭ-целлюлозу для очистки протофрадина от балластных белков и пигментов;

Гельфильтрация на акрилексеП-10 протофрадина, очищенного на ДЭАЭ-целлюлозе, для отделения больщей части сопутствующих протеаз;

хроматография иа КМ-целлюлозе частично очищенной на предыдущих стадиях трипсиноподобной протеиназы для отделения примеси АТЭЭ-эстеразы с применением для вымывания белков линейного градиента

NaCl;

обёееоливание целевого продукта на колонке с сефадексом Г-15.

Гомогенность полученной протеиназы доказана методами ультрацентрифугирования, электрофореза, изоэлектрического фокусирования и гельфильтрации.

Полученный предлагаемым способом фермент стабилен в области рН 2,0-10,0, причем в интервале рН 2,0-4,0 сохраняется 100% активности. При прогревании фермента при 60°С в течение 10 мин сохраняется 19% активности фермента.

Пример 1. 7 г лиофильно высушенного протофрадина растворяли в минимальном количестве воды и наносили на колонку (5X60 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,015М фосфатным буфером рН 8,0. Колонку промывали тем же буфером. Элюат собирали, осаждали 3,5 объемами этанола, растворяли в воде и лиофильно высушивали.

Лиофильно высушенный белок наносили на колонку (3,7X80 см) с акрилексом П-10, уравновешенную 0,05М фосфатным буфером рН 6,0. Скорость элюции 20 мл/ч, объем фракции по 10 мл. Фракции, обладаюш,ие наибольшей трипсиновой активностью, объединяли и непосредственно наносили на колонку (1,7X18 см) с КМ-целлюлозой К-32, уравновешенную тем же буфером, который применялся для гельфильтрации на акрилексе П-10. Скорость элюции 12 мл/ч, объем фракции 6 мл. Для вымывания белков из колонки применяли линейный градиент NaCl в исходном буфере с концентрацией соли О-0,2М в объеме 600 мл.

Фракции, соответствующие пику трипсиноподобной протеиназы, объединили и проводили их обессоливание на колонке (1,7X20 см) с сефадексом Г-15. Скорость элюции 12 мл/ч, объем фракции 3 мл.

Определение эстеразной активности фермента. В ходе очистки активность трипсиноподобной протеиназы определяют колориметрическим методом с использованием

в- качестве субстрата М-/г-тозил-Ь-аргининметилового эфира (ТАМЭ).

К 0,2 мл 0,020 Л1 раствора ТАМЭ в 0,1 М трис-Оуфере рН 8,6 приливают 0,1 мл исследуемого раствора фермента. Проводят инкубацию в водяной бане при 37С в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением 0,3 мл 2М раствора гидроксиламина и 0,3 мл 3,5 н. раствора NaOH. Пробу выдерживают 25 мин при комнатной температуре. Добавляют 5 мл О,ИМ раствора хлорного железа и тш,ательно перемешивают. В пробах развивается оранжево-красная окраска, которую измеряют через 10-15 мин против пробы на реактивы

(0,3 мл трис-буфера-f 0,3 мл раствора гидроксиламина + 0,3 мл раствора ЫаОП-Н

+ 5 мл хлорного железа).

Контроль на ТАМЭ: 0,2 мл 0,025М раствора ТАМЭ 4-0,1 мл трис-буфера рН 8,6, инкубация в течение 10 мин и далее, как при определении активности.

Предлагаемый способ позволяет выделять трипсиноподобную протеиназу из отечественного штамма актиномицета, а также получать фермент, обладаюш,ий повышенной термо- и кислотостабильностью;

Формула изобретения

Способ очистки микробной трипсиноподобной протеиназы с помош;ью хроматографии и гельфильтрации, отличаюш,ийс я тем, что, с целью расширения сырьевой базы и получения фермента, обладаюш,его повышенной термостабильностью н стабильностью в кислой среде, в качестве микробной протеиназы используют протофрадин, осуш,ествляют хроматографирование ее на ДЭАЭ-целлюлозе и после гельфильтрации на акрилексе повторно хроматографируют на КМ-целлюлозе и сефадексе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Biochem. Biopkus. Acta, 139, 382, 1967.