Способ выделения лактопероксидазы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к биохш ической промышленности, а именно к получению особо чистых биохимических препаратов и может {Илть использовано в научно-исследовательской работе

Лактог1ероксидаэа применяется для иодирования белков-и липидов, при поставке paдиoи wyнoлoгичecкoгo метода исследования (РИМ), иммуноферментного метода. Ее бактерицидные свойства могут быть использованы для стерилизации молочных продуктов.

Известны способы выделения и очист и лактопероксидазы (ЛПО) из слюны человека и молока крупного рогатого скота с помощью комбинации методов: ирннообменной хроматографии, гель5сроматографии на сефешексах, выса1ливания сульфатом аммония, иэоэлектрофркусирования на амфолитак 3

Наиболее близким по технической сущности является способ выделения лактопероксидаэы из молока коров путем сорбции сырья на карбоксиметилсефадексе, элюции 0,02М wtj uc-HCl буфером, рН 7,4, содержащим 0,2 м NaCl, высаливания фермента из элгоата сульфатом аммония при степени насыщения 60-70% и изоэлектрофокусирования на амфолитах t2j.

Однако на этапе сорбции лактопероксидазы СЛПО) на КИ-сефадексе казеин выпадает в осадок. Твердые частицы казеина способствуют агре1 ации сефадекса, чтр препятствует присоединению лактопероксидаэы, затрудняет ее последующую элюцию и исключает возможность многократного использования КМ-сефгшвкса.

Низкая концентрация белка в элюате (материал после ионнообменной хроматографии) приводит к его потерям при дробном высаливании сульфатом амчония, так как при добавлении соли Образуется тонкая взвесь белка, которую трудно полностью извлечь из раствора. .

Изоэлектрофокусирование на амфолитах - длительный процесс, так как естественный градиент рН (на основе полиаминополикарбоновьсх кислот образуется в результате 20-часового предварительного электрофореза, а весь процесс разделения белков на амфолитах занимает около 60 ч. В результате выход целевого продукта недостаточно высок, а продолжительность способа длительна.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и ускорение способа его выделения.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу ввделения .лактопероксидаэы из молока коров включакяцему сорбцию на карбокснметилсёфадексе с элюцией 0,02 м трг с-НС1 буферам, при рН 7,4, содерхащим 0,2 м NaCl, высаливание фермента сульфатом .аммония при 60-70%-ной степени насыщения и изоэлектрофокусирование, предварительно осаждают казеин из молока при рН 4,0-4,5 с отделением осадка центрифугированием концентрируют элюат микрофильтрацией 8 10-15 раз по сравнению с исходиь объемом на мамЪране из сополимера метилметакрилата м винилпирролидона с дианетром пор 200 + 20А, и проводят Изоэлектрофокусирование в линейном градиенте рН 7,4-10,0, который создают борат-полиольньаии буферными растворами.

Удаление казеина из молока перед сорбцией ШО на КМ-сефадексе способствует, увеличению емкости ионообменника по целевому продукту (казеин в данном случав является бaллacтньavl белком), что приводит к повышению выхода ЛПО и ускорению процесса сорбции и дальнейшему выделению.

Концентрирование элюата (раствора белка, десорбированного с КМ-сефадекса) позволяет сократить потери белка при последуюв ем высаливании сульфатом аммония, благодаря образованию более плотного осешка и, следовательно, более полному отделению его, и сократить длительность процесса. Введение этого этапа в способе выделения и очистки ЛПО также приводит к повышению выхода целевого продукта.

Проведение иэоэлектрофокусирова-кия не в ест ственном градиенте рН ( устанавливается в процессе электрофореза амфолитов), а в искусственном градиенте рН (устанавливается путем искусственного последовательного наслоения борат-полиольных буферных растворов с различными значениями рН) в диапазоне рН 7,4-10,0 ускоряет и удешевляет способ. Это позволяет также избежать основных потерь активности при сокращении длительности процесса. Проведение одного опыта предлагаемом способом в 100-120 раз дешевле по сравнению с известньл способом. Создание искусственного линейного градиента рН занимает около 30 мин, а процесс разделения белков в этом градиенте рН длится 2024 ч.

Термином искусственный градиент р пользуются в методе изоэлектрофокусирования в борат-полиольных буферных системах для того, чтобы подчеркнуть его П1%1нципиапьное отличие от электрофокусирования в амфолитах 3j.

Пример 1 . Для выделения ЛПО берут 6 л коровьего молока, которое хранят при температуре . Молоко предварительно обезжиривают центрифугированием при 300 об/мин в течение 30 мин на центрифуге S - 70 ( 2600 д). Казеин осаждают при рН 4,0-4,5 , установленном с помощью 0,5 м раствора НС1, рН в растворах определяют с помощью рН-метра ЛПУ - 01, Осадок казеина отделяют центрифугированием при 300 об/мин в течение 20 мин на центрифуге S-70. Затем к молочной сыворотке добавляют сухой необработанный КМ--се4)адекс С-50 из расчета 2 г на 1 л сыворотки. Сорбцию ЛПО на ионообменном сефадексе ведут в течение 5 ч при комнатной температу ре при ПОСТОЯННО перемешивании. Сефадекс отделяют на воронке Бюхнера и прсавйвагот 2 л воды, а к фильтрату добавляют новую порцию сефадекса и рроводят повторную сорбцию ЛПО. ЛПО ЭJEoиpyют на воронке Бюхнера 0,02 Kfnf zec-UCl буфером, содержащим 0,2 М NaCl (рН буфера соответствует рН молочной сыворотки, отделенной от сефадекса), Буфер порциями по 50 мл осторожно наслаивают на сефадеке и через 10-15 мин отсасывают под вакуумом при давлении 0,02 атм. Элюацию заканчивают, когда оптическа Плотность элюата при длине волны 412 нм становится равной нулю. Сефа деке после окончания элюйции регене Тадруют, обрабатывая его последовлтельно 0,5 М NaOH и 0,5 Н НС1, и ис пользуют в дальнейших опытах. Элюат { 1 л) концентрируют микрофильтрацией на мембране Рипор-3 до 100 мл с помсицью прибора ФМ-05 п давление - 4 атм. Концентрированный элюат подвергают дробному высаливанШо сульфатом аммония. Осадок белка (55,8 мг полученный в пределах насьвдения элюата сульфатом аммония 60-80% (гр бая ЛПО), диализуют в течение суток против проточной водаа и в течение суток против буфера 0,3 М борная кислота 0,33 litttpus -f рН 8,3 и использ5 ют для иэбэлектрофокусировани в искусственном рН-градиенте. Искусственный градиент рН 7,4 Юг О создают следуимаим образом, Буферные растворы с рН 7,4-8,3 г товят, добавляя к основному буферному раствору 0,3 М борная кислота 9,33 , рН 8,3 глицерин, дотитровывая раствор до требуемой величины рН. Буферные растворы с рН 8,3-10,0 готовят путем подщелачи вания основного буферного раствора аммиаком. Буферные растворы с рН 7,4; 7,б 7,8 8,If 8,3, 8,5} 8,7; 9,0; 9,2, 9,4; 9,,0 объемов по 2,5 мл последовательно: наслаивают с помощью перистальтического насоса в ана литическую колонку для изоэлектрофокусирования. (Грубую ЛПО наносят в объеме 0,5 мл мг белка, удельная активность 0,350) после буферного раствора с рН 7,8, соответствую1цего раствору по плотности, которую определяют на рефрактометре РПЛ-3. В качестве электродного буфера используют основной буферный раствор: 0,3 м борная кислота - 0,33 Mfnpuc-, рН 8,3. Изоэлектричёское фокусирование проводят в аналитической колонке объемом 50,0 мл в течение 16 ч. Напряжение на электродах 750 В (градиент напряжения 15 В/см) создают с помощью источника постоянного тока. После окончания электрофореза содержание колонки отбира;ют сверху фракциями объемом по 3 мл. Фракции диализуют против 0,85%-ного раствора Nad, определяют в них концентрацию белка и ферментативную активность, рассчитывают удельную активность фермента и строят электрофореграммы. Степень очистки препарата после изоэлектрофокусировакия определяют методом электрофореза в 7,J%-HOM полиакриламидном геле в кислой среде, рН 3,2. Результаты опыта представлены на фиг. 1. Белок проявляет наибольшую пероксидазную активность в двух зонах: с рН 8,1 и рН 9,9. Белок с изоэлектрическойточкой 9,9 образует при электрофорети еском разделе- i НИИ в полиакриламидном геле одну сдвоенную полосу ( фиг. 2). В коммерческом препарате ЛПО, выпускаемой фирмой Sigma, наблюдаются две дополнительные диффузные белковые зоны, обнаруживаемые в препарате грубой ЛПО и отделяемые при изоэлект.рофокусировании в. искусственном линейном градиенте рН 7,4-10,0. Общее количество препарата, получаемое в эднс опыте, составляет 11,9 мг. (материал с 25 аналитических колонок для изоэлектрофокусирования).л Пример 2 . Выделение в очистку проводят аналогично примеру 1. Отличия заключаются в кони.ентрировании элюата микрофнльтрацией в 15 раз, что не приводит к существенному увеличению количества белка, госаждаемого на последующем этапе выделения, и в изменении нагрузки на колонку. Для очистки изоэлект« рофокусированием в одну аналитическую колонку вносят 4,0 мг белка. Результаты опыта представлены на фиг. 3. Максимальную удельную активность проявляют белки с изоэлектрическими точками 8,0 и 9,9, что является свидетельством хорошей воспроизводимости получаемых результатов, приведенных в примере 1. Небольшой пик с изоэлектрической точкой 8,05 образуется, возможно, при большей нагрузке на колонку за счет минорного компонента грубой ЛПО.

С одной аналитической колонки в данном опыте получают 400 мкг белка.

Показатели общего количества белка, Получаемого из 1 л коровьего молока на различных стадиях выделения и очистки лактопероксидазы (ЛПО приведены в таблице.

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЛАКТОПЕРОКСИДАЗЫ из молока .коров, включающий сорбцию сырья па карбоксиметилсефадексе с элюцией 0,02 м m/utf-HCl буфером, содержащим 0,2м NaCl,, при рН 7,4, высаливание фермента сульфатом аммония при 60-70%-ной степени насыщения и иэоэлектрофокусирование, отлич ающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и ускорения процесса, из молока предварительно осаждают казеин при рН 4,0-4,5 с отделением осадка центрифугированием, элюат с карбоксиметилсефадекса концентрируют микрофильтрацией в 10-15 раз по сравнению с исходным объемом на мембране из сополимера метилметакрилата (/) и винилпирролидона с диаметром пор 200 + 20А, а изоэлектрофокусирование проводят в линепном градиенте рН 7,410,0, который создают борат-полиальными буферными растворами.5 Ю,0 рН S 6 7 8 3 W щ (рроиции

Сорбция на КМ-сефадексе

Дробное выоалива;Ние сульфатом аммония

ИзоэлектрофокусиОчищенная ЛПО рование

Выход ЛПО

Степень чистоты (см. фиг. 2)

Таким образом, предлагаемый способ выделения и очистки ЛПО позволяет повысить выход ЛПО приблизительно в 10 раз по сравнению с известньин см. ,таблицу, благодаря более полной сорбции ЛПО на КП-сефадексе и последукицей ее элюации, а также в результате сокращения потерь белка на этапе дробного высаливания /сульфатом аммония; ускорить Jг poцecc выделения и очистки ЛПО в два раза

22 0,98

200 9,3

0,2

1,9 1,9 0,2

Одна сдвоенная полоса и 2 диффузные зоны (электрофорез в ПААГ)

за счет изоэлектрофокусирования в искусственном рН-градиенте} понизит стоимость выделения и очистки ЛПО, благодаря многократному использованию КМ-сефадекса и применению дешевых отечественных реактивов для создания рН градиента. Эксперимент по изоэлектрофокусированию на амфолитах стоит 28 руб., а в искусственном рН-градиенте 40 ком.

s

Pl3.3

34 S 6 Фиг.З

ЮрН

S,5

S.5

Sfl

7 8 3 Ю H qppaxnuu