13-(1-ОКСИЛ-2,2,6,6-ТЕТРАМЕТИЛПИПЕРИЛИДЕНИЛ-4)ГИДРАЗОН РУБОМИЦИНА ХЛОРГИДРАТ С ПАРАМАГНИТНЫМ ЦЕНТРОМ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Советский патент 1995 года по МПК C07H15/252 A61K31/70 

Изобpетение относится к фармацевтической промышленности, в частности к биологически активным соединениям, обладающим противоопухолевой активностью, и касается производных рубомицина.

Известен рубомицин (даунорубицин), который применяется в клинике при лечении острых лейкозов, хорионэпителиомы матки, опухолевых ретикулезов.

Однако рубомицин обладает также различными видами побочного действия: кардиотоксичен, угнетает кроветворение, имеет ограниченный спектр действия и недостаточно высокую противоопухолевую активность.

Известны также производные замещенные гидразоны даунорубицина (рубомицина) общей формулы
где R COCH₃; -COC₂H₅; -COCH(CH₃)₂; -CO(CH₂)₁₄CH₃; -COC₆H₅; -COC₆H₄; -COC₆H₄ (n-OCH₃); -CHO, обладающие противоопухолевой активностью.

Большинство этих соединений сохраняет активность даунорубицина, некоторые имеют более низкую токсичность. Среди них наилучшим является бензоилгидразон даунорубицина (рубидазон, R COC₆H₅, который обладает меньшей кардиотоксичностью.

Цель изобретения получение нового, более эффективного соединения, обладающего пониженной токсичностью, более высокой противоопухолевой активностью и более широким спектром действия.

Поставленная цель достигается путем получения нового производного рубомицина, а именно 13-(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперилиденил-4)гидразон рубомицина хлоргидрата с парамагнитным центром проявляющего противоопухолевую активность.

По химическому строению данное соединение представляет собой несимметричный бис-гидразон, который можно рассматривать также как несимметричный азин, и является новым типом производных рубомицина, в молекуле которого имеется парамагнитный центр. Соединение условно названо Рубоксил.

Данное соединение тормозит рост злокачественных опухолей и может быть применено в онкологической практике для лечения злокачественных заболеваний крови и опухолей различных локализаций, обладает пониженной токсичностью, а также более высокой противоопухолевой активностью и более широким спектром действия по сравнению с указанными известными соединениями.

Наличие парамагнитного центра в соединении дает возможность проводить фармакокинетические исследования методом ЭПР (электронного парамагнитного pезонанса). Это позволяет проследить за накоплением и выведением препарата, содержащего в качестве действующего начала данное соединение, из органов и тканей животных и человека, не прибегая к синтезу меченого соединения, представляющего собой активный изотоп.

Новое соединение с парамагнитным центром представляет собой красное кристаллическое вещество, растворимое в воде, этиловом спирте, хлороформе.

Спектр ЭПР триплет c αN 15,6 г_с Тпл. 175-176^оС (разложение) [n]_D²⁰ + 264^о.

Найдено, C 59,02; 58,80; H 6,42; 6,57; N 7,60; 7,55.

C₃₆H₄₅N₄O₁₀ ˙HCl
Вычислено, C 59,20; H 6,36; N 7,68.

ИК-спектр (KBr): отсутствует полоса с ν1720 см^-1, характерная для группы С= О при С₁₃ рубомицина, присутствует полоса с ν1680 см^-1, характерная для группы C=N.

Цель изобретения новый способ получения 13-(1-оксил-2,2, 6,6-тетраметилпиперилиденил-4)гидразона рубомицина хлоргидрата.

Поставленная цель достигается тем, что хлоргидрат рубомицина обрабатывают щелочным агентом для перевода хлоргидрата в основание рубомицина, затем осуществляют взаимодействие основания рубомицина с гидразоном 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидона-4 при их молярном соотношении 1:1,5-2 в среде хлороформа и метанола, взятых в объемном соотношении 8:1, в присутствии уксусной кислоты, взятой в четырехкратном молярном избытке по отношению к основанию рубомицина, при 20-25^оС с последующей обработкой, а оставшийся отделенный от осадка раствор, содержащий продукт реакции, обрабатывают спиртовым раствором хлористого водорода, взятого в двухкратном молярном избытке по отношению к основанию рубомицина, полученный продукт осаждают диэтиловым эфиром. Целевой продукт выделяют известными приемами.

Взаимодействие основания рубомицина с гидразоном 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидона-4 и последующая обработка полученного продукта реакции хлористым водородом протекают по следующей схеме:

Способы получения несимметричных азиновых производных антрациклиновых антибиотиков неизвестны. При действии гидразонов на хлоргидрат рубомицина происходит их диспропорционирование с образованием смесей двух симметричных и несимметричных азинов. При действии гидразонов на основание рубомицина в спиртах также происходит их диспропорционирование.

П р и м е р. Cинтез 13-(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперилиденил-4)гидразона рубомицина хлоргидрата.

К раствору 1,5 г (2,66 ммоль) хлоргидрата рубомицина в 50 мл воды добавляют 25 мл 0,2 н. Na₂CO₃, основание рубомицина экстрагируют 250 мл хлороформа, экстракт упаривают в вакууме до объема 75 мл и добавляют 0,9 г (4,9 ммоль) гидразона 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидона-4, 0,5 мл уксусной кислоты и 10 мл метанола. Раствор выдерживают в течение 2 суток при 20-25^оС, осадок отфильтровывают, к фильтрату добавляют 10 мл 0,6 н. HCl в метаноле и продукт осаждают диэтиловым эфиром.

Получают 800 мг 13-(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперилиденил-4)гидразона рубомицина хлоргидрата (выход 41,5% от исходного хлоргидрата рубомицина).

В системе хлороформ метанол вода (объемное соотношение 13:6:1)R_f для полученного целевого продукта равно 0,64, для хлоргидрата рубомицина R_f равно 0,55. Активность в отношении Bacillus mycoides составляет 26% от активности хлоргидрата рубомицина.

Соединение испытывают в эксперименте на животных на биологическую активность. При этом острую и хроническую токсичность указанного соединения определяют на белых беспородных мышах и оценивают по методу Бернса. Под острой токсичностью понимается однократное введение соединения, под хронической многократное, в данных экспериментах семикратное ежедневное. 13-(1-Оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперилиденил-4)гидразон рубомицина хлоргидрата вводят внутрибрюшинно в физиологическом растворе при концентрации соединения в растворе ≈01, Определяют дозы, вызывающие гибель 50% животных (LD₅₀) и максимально-переносимые дозы (МПД). Данные по токсичности нового соединения в сравнении с рубомицином и рубидазоном приведены в таблице.

Противоопухолевую активность определяли на моделях экспериментальных лейкозов La, P-388, L-1210, перевиваемых на мышах ВДF₁, и на солидной опухоли эритромиелоз Швеца у крыс. Во всех случаях данное соединение и известные (рубомицин и рубидазон) используют, растворяя их в физиологическом растворе, и вводят при лечении внутрибрюшинно. Указанные соединения начинали вводить на следующий день после прививки опухолей. На всех моделях применяемые дозы нового соединения и рубомицина были эквитоксичными. На модели лейкоза Lа соединение по предлагаемому способу вводят ежедневно в дозе 5 мг/кг в течение 7 дней, рубомицин по той же схеме в дозе 0,5 мг/кг. Лейкемию Р-388 лечат данным соединением в дозе 15 мг/кг, вводимой через 72 ч 7 раз. Рубомицин вводят в дозе 1,4 мг/кг по той же схеме, рубидазон ежедневно в течение 9 дней в дозе 4 мг/кг. Лейкемию L-1210 лечат данным соединением в дозе 20 мг/кг.

Сделано 4 инъекции. Интервал между инъекциями 6 сут. Рубомицин вводят в дозе 2,8 мг/кг по той же схеме. Рубидазон вводят в максимально переносимой дозе 1,5 мг/кг ежедневно в течение 9 дней. В экспериментах лейкемию L-1210 перевивают лейкемическими клетками, взятыми в количестве 10⁵, в то время, как при испытании противоопухолевой активности рубидазона лейкемию L-1210 перевивают меньшим количеством клеток, а именно 10³. Наличие меньшего количества лейкемических клеток создает более благоприятные условия для химиотерапии в случае использования любого противоопухолевого агента, в том числе рубидазона.

Критерием противоопухолевой активности на моделях Р-388 и L-1210 является увеличение средней продолжительности жизни леченых животных по сравнению с контрольными по формуле,
100-100 где величина, на которую увеличилось среднее время жизни леченых животных по сравнению с контрольными;
L_оп время жизни животных в леченой группе;
L_к время жизни животных в нелеченой контрольной группе.

На модели лейкоза Lа критерием противоопухолевой активности являлся кинетический критерий (κ), который показывает во сколько раз по сравнению с контролем тормозится лейкозный процесс при применении нового соединения и рубомицина.

Из таблицы видно, что как острая, так и хроническая токсичность предлагаемого соединения значительно ниже токсичности известных соединений.

Данное соединение значительно увеличивает среднюю продолжительность жизни животных с экспериментальной лейкемией Р-388 по сравнению с действием рубомицина и рубидазона, а в случае L-1210 увеличивает среднюю продолжительность жизни животных по сравнению с действием рубомицина. В случае лечения рубидазоном лейкемии L-1210 условия эксперимента были гораздо мягче, чем в настоящем эксперименте (прививка происходила в 100 раз меньшим количеством клеток и лечение было ежедневным, а не раз в шесть суток, как в предлагаемом эксперименте). Отсюда и более высокий результат по средней продолжительности жизни животных, равной 90% (соответствующий процент для нового соединения, согласно таблице, равен 76,0). Использование же рубидазона в условиях настоящего эксперимента привело к более худшему показателю по средней продолжительности жизни по сравнению с действием предлагаемого соединения.

При использовании для лечения эритромиелоза Швеца рост опухоли тормозится на 80% по сравнению с контролем. Применение рубомицина не дает никакого эффекта.

Таким образом, предлагаемое новое соединение обладает более низкой токсичностью и более высокой противоопухолевой активностью по сравнению с известными сравниваемыми соединениями и представляет значительный интерес для использования в фармацевтической промышленности и медицине.

Предварительная клиническая апробация предлагаемого соединения на небольшом количестве опухолей разных локализаций позволяет рекомендовать это соединение в качестве действующего начала лекарственного препарата при лечении злокачественных заболеваний крови, опухолей легкого и желудочно-кишечного тракта.

Лекарственный препарат на основе данного соединения рекомендуется выпускать в виде порошков, таблеток, капсул для введения в виде раствора в физиологическом растворителе для парентерального введения ex tempore.

Рекомендуемая доза для однократного введения препарата 400 мг/м². Более эффективным является лечение большими дозами с длительными интервалами между введениями лекарственного препарата (например, 1000 мг/м² один раз в две недели).

Лекарственный препарат рекомендуется хранить в темном холодном месте при температуре от 2 до 0^оС. Порошки, таблетки и капсулы хранят в обычной картонной упаковке. Растворы для парентерального введения хранят во флаконах.

1. 13-(1-Оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперилиденил-4)гидразон рубомицина хлоргидрат с парамагнитным центром формулы

проявляющий противоопухолевую активность. 2. Способ получения 13-(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперилиденил-4)гидразона рубомицина хлоргидрата по п.1, отличающийся тем, что хлоргидрат рубомицина обрабатывают щелочным агентом, затем осуществляют взаимодействие полученного основания рубомицина с гидразоном 1-оксил-2,2,6,6-пиперидона-4 при их молярном соотношении 1 1,5 - 2 в среде хлороформа и метанола, взятых в объемном соотношении 8 1, в присутствии уксусной кислоты, взятой в четырехкратном молярном избытке по отношению к основанию рубомицина, при 20 25^oС с последующей обработкой отделенного от осадка раствора спиртовым раствором хлористого водорода, взятого в двухкратном молярном избытке по отношению к основанию рубомицина, и выделение целевого продукта с осаждением диэтиловым эфиром.