Нитроксильные производные нитрозомочевины, проявляющие противоопухолевую и мутагенную активность Советский патент 1990 года по МПК C07C275/68 A61K31/17 A61P35/00 

«,

Изобретение относится к-зювым про

иэводным нитрозомо.чевнны, которые могут найти применение в биологии и медицине.

Пред.пагаемые нитроксильные производные нитрозомочевины обп;ей формулы ,

R, (СН,)Ж C(0)N(NO)R;j, где ,2,6,б-тетраметил-1 оксил 4- пиперидил, или 4 карбокси-2, 2,6,б-тeтpaмeтнл-l oкcил 4- пипepидил, или 2,2s5a5-TeTpa- . метил-1-сксил-З-пирролидил; Rj, - И или метил; RJ - метил-или 2-хлорэтил5 . п.0-2, . . могут, использоваться как противоопухолевые средства, химические мутагены и как спиновые метки в биологических исследованиях. Наличие парамагнитных свойств у предлагаемых сое диненин позволяет, путем примененпя метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), упростить контроль

НзС. Шз

НзО.СНз

Rr). ..7.. HoocV

НзС СН-зн с СЩ

Соединения (J-IV) обладают парамагнитным центром N О, который яв-- ляется составной частью заместите- .

.лей . , .

Нитроксильные -производные нитро- .зомочевины (Ir-IV) получают обменной- реакцией из .аминорадикагюв : R,(CH,) NHRJ (Vf1-a-e;. а) R, - E 6) R,R, Rj,, в) R,R, R,H., r) , R,-H., .д) R,R,, R,CHj, e) , R,,Hj ) и сукцинимидных эфироз iN-Rj - N-нитрозокарбаминовой кислоты (VDJ а,б)

Q Ш

-О-С- -Нз

где (Vffl а);

R CHjCH C1 (Vffl6). Строение полученных соединений одйозначно подтверждается элементным анализом и методами ЭПР-, ИК-, УФ- и масс-спектрометрии.

596505 . :

исследуемого процесса. Возможность определения Локализации парамагнитных г:репаратов вплоть до клеточного уровня делает эти соединения незаме5 нимыми при изучении механизма действия веп(еств, обладающих противо-. опухолевой или мутагенной активностью.

Целью изобретения является полуJO чение новых химических соединений, обладающих противоопухолевой и/или мутагенной активностью. Соединения могут быть использованы в качестве спиновь х меток i .

fS Нитроксильные производные нитрозомочевины имеют обпгуго формулу Rj(CH)(0)B(NO)R,

где . R,R, R.-H, ,, (I); ; . 20 R,H, , ,, (LI); R,R4, , ,CHjCl, (III); , R,H, ,CHjCl, (IV)} R,R, , , Rj CH CHjCl, (V); R,-R, , R,H; R,CH,OT,C1, (VI);

NI

N-0

НзС СН

В ИК-спектрах нитрозомочевины (I-1V, VI) -в области 3270-3340 п«1еется по одной узкой полосе средней интенс5шности, отвечающей валентным колебаниям связи N-H. Эта полоса отсутст вует в спектре соединения (V)5 где- R СН . Наличие электроотрицательной нйтрозогруппы на

фрагменте карбамида в спектрах производных (I-VI) отражается в -виде смещения полосы карбонильной группы в сторону высоких (1690-1730 см ), а

полосы амид II (C-N-H)- в сторону низких частот (1520-1540 см по сравнению с частотами соответствующих полос в спектрах алкил гочевины - (см. табл. 2).

Электронны1г спектры спиртовых растворов соединений (I-VI) в.области 200-800 нм содержат полосы поглощения нитрозоуреиДного и нитрок- сильного хромофоров. В видимой облас- . ти спектра первому отвечает полоса с

центром около 400 нн, которая для соединений (I-ffl,V) частично, а для соединений (IV, VI) полностью перек- рьшает более полосу поглощения нитрокёильной группы.

3

в УФ-области спектра имеется одн широкая полоса с максимумом около 235 нм, обусловленная наложением поглощений нитрозоуреидной и нитрок- сильной групп (см. табл. 2).

Парамагнетизм полученньйс соединений подтрерждается методом ЭПР, Спектры ЭПР разбавленных растворов (i-VI) состоят из трех линий равной интенсивности, что типично для нит рокснпьных монорадикалов. Константы сверхтонкого взаимодействия t( ннтро зомопевины (I-VI) (см. табл. 2) характерны для нитроксильньтх радикалов пиперидинового ряда.

П р и мер. Получение предлагаемых соединений: 2,2,6,6-тетраметил- -4- (3-метил-З-нитрозоуреттдо) пиперидин-1-оксила (I), 2,2,6,6-тетраметил -А- 3-нитрозо-3-(,2-хлорэтил)уреидо- метил пиперидин-1-оксила.(П), 2,2,6, б,-тетраметил-4- 2- 3-нитрозо-3-(2- -хлорэтил) уреидо -э.тил -пиперидин-1 - оксила (Ш), А-карбокси-2,2,б5б-тет- раметил-4- 3-нитрозо-3-(2- слорэтил) уредио пиперидин-1-оксила (IV), 2,2, 6,6-тетраметил-А- 1-метил-3-нитрозо- -3-(2-хлорэтил)уреидоЗ пиперидин- - оксила (V) и 2,2,5,5 тетраметил-3- -j 3-нитpoэo-3-(2-xлopэтил)-уреидо пирролидин-1-оксила (VI).

К растнору I1 моль сукцинимидного зфира Н-нитрозо-Ы-метнл или N-иитро зо-Н-(2-хлорзтил)-.карбаминовой кислоты (Villa) или () в 5 мл сухого диметилформамида при охлаждении до О С и перемешивании добавляют по каплям раствор 10 ммоль соответствующег аминорадикала (Vn) в 5 мл диметил- 4юрмамида. Реакционную смесь переме- пгавают 30-120 мин при и вьщивагот на 100 г толченого льда. Образовавшийся осадок отделяют, промывают водой и сушат., Перекристаллизацию (1, n,IV,VI) проводят из растворителей, указанных в табл. 1. Образующиеся в .виде масла вещества (Ш) и (V) зкстра- гируют эфг ром (3x20 мл), экстракт суюат и хроматографируит на колонке с силикагелем,, элюент-СНС1з- ;-ацетон-СН ОН (10:1:1) или (9:1).

Реакцию нитрозокарбамата () с аминокислотой (Vllr) проводят в присутствии 0,5 ммоль триэтиламина.

Выходу, температуры плавления и данные по элементному анализу соединений (I-VI) приведены в табл. 5 , а их спектральные свойства - в табл. 2.

го.

.59Г)

Полученные в параллельных опытах данные биологических испытаний соединений (I-VI) и ближайшего аналога 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-ннт- с розомочевииы (ЦГНМ) приведены в табл. 3. ,

Производные (I-V) и ЦГНМ исследованы в виде эмульсий, в 10%-нрм водном pacTBojse твнна -80, а соединение to (VI) - в виде расд-вбра в 10%-иом водном спирте. .

Токсичность предлагаемых соединений, определяют при однократном введении на белых беспородньтх мышах ,5 по методу Бернса. В качестве характеристики токсичности использована величина дозы, вызьгаающей гибель 50% животных, взятых в опыт (LDjg) . . Результаты испытаний показали, что предлагаеьше нитроксильныё.производные (I-VI) в f,7-5 раза менее токсичны, чем ЦГНМ.

Определение протнвоопзгхолевой активности проведено на опухолях мы- 25 шбй - перевиваемых внутрибрюшинно лейкемиях La L-1210 и Р-388 и перевиваемой в мозг лeйkё. L-1210.

Лейкемию La перевивают, внутрибрюшинно взвесью лейкемических клеток в физиологическом растворе. Ино- кулум содержит 0 лейкемич.еских клеток, спытьтаемые соединения вводят также внутрибрюшиттно, причем первое введение осуществляют через 3 ч после перевивки опухолиj а за- 5 тем - ежедневно .

Лейкемию Р-388 перевивают внут- рибрюшинно (10 клеток в 0,2 нп асцитной жидкости). Соединения (Ш, V,VI) и ЦГНН вводят также внутри- брюшинно, ежедневно, начиная через I сут после перевивки опухоли.

Лейкемию L-12IO перевивают внут-. . рибрюшинно (10. клеток-в 0,2 мл асцитной ж 1-щкости) и в (10 кле- 5 ток в 0,06 мл физиологического

раствора). Испытываемые соединения вводят внутрибрюшинно, ежедневно, -начиная через 1 сут после перевивки опухоли.

0 Схемы лечения для каждого опыта приведены в табл. 3.

В большинстве опытов дозы предлагаемых соединений и доза,. 15 мг/кг пре.ларата сравнения (ЦГЫМ) экви- 5 .токс1Г 1ны и составляют 0,3 от LD. Дпя соединения (VI) применена доза

20 мг/кг, что составляет 0,23 от

V . :

30

5

, Критерием противоопухолевой ак тивности на лейкемиях Р-388 и L-i210 является увеличение «:редней продолжительности жизни (УПЖ)опытных живот ных ito сравнению с контрольными, вы- ражейное в процентах и вычисляемое по формуле ,

УМ -lOOjbilkl. .Ьк.

где LbK среднее время жизни живот. ных в опытной rijynne; L - - среднее время жизни животных в контрольной группе без введения исследуемых соединений.

В случае с лейками Ьа применяют кинетический критерий противоопухолевой активности Зе, которьй харак- ;теризует степень торможения скорости роста опухоли под действием испытуемого соединения:

1-ч,„ / .;

где ЛС,

оп к

и У - удельные скорости рос та опухоли в опыте и

Ннтроксипьныв прО 5зводные (I-VI)

Коясзяочкая хроматографняг на сшшкагелв, 9Л1вант-СНС1з-ацето«-МеОН (0;ltl)

59650

. ;., .контроле соответствен . но.

Как видно из табл. 3, бощ шинство предлагаемых соеди теннй обладает вы- 5 сокой антилейкемияеской активностью.

Так, соединения (П-V) в лейкемии La по кинетическому критерию эс в 3-4 раза эффективнее, чем .ЦГНМ.

10 Соединения (Ш) и (VI) по своему терапевтическому действию на лейкемию Р-388 близки ДГНМ, а соединение (V) на этом штамме по показателю,УПЖ в 1,5 раза эффективнее, ЦГНМ, п, 15 обеспечивает извлечение 50% животных, взятых а опыт. . При перевитой внутрибрююинно и в мозг лейкемии L-I210 эффективность действия соединений (V,VI) при анат 20 логичных схемах лечения сравнима с действием ЦГНМ, причем для (VI) такая эффектитзнссть достигается при . более низкой относительной дозе (0,23 от LDgp, чем для ЦГНМ (0,32 от 25 Щ.

Т в л я а и I.

ИК-, УФ-, ЭПР- и масс-спектры нйтроксильных производных

(I-VI)

п

ш

IV

1,55

257

1,56

319,321

1.55

333,335

1,50

349,351

«

Для соединения П приведен спектр жидкости, для остальных веществ - спектры в вазелиновом масле.,

Растворитель - спирт. Раствор в бензоле, 25 С, концентрация 510 моль/л.

.,Тябл(1иаЗ

- -. -- 1Г вэУпьтат« язучеяня протявоопухолевоР aKTHBirocTU интроксилыпЛ пронэводимх (I-VI).

Томич- яреть, .мг/кг .

KttBOTHue I

,

ЛИНЯЯ

Опуколь

f

v

230 100 В0

.150 . 150

ВП

q,i

MJSA

с„в

.ОВД,

U

U Р-338

U .

La Р-Э88

в/ в/б в/б в/б в/б в/б в/б

9,0 6,0 6.0

10,2 6,0 6,0

10,2

сяектр,

ах, мТ

()

Гй/ё й )

1-5 0-4 0-4 1-5 0-4 0-4 t-5

6 7 1 6 6 6 6

С О

о о о о

3

0,7 0,6

о,я

0,7

15

fSO

310

Соединепия (I-V) и ЦГНМ иепытываяя в виде эмульсин в ОХ.-но:м водном растворе тпнма-ЯО, а соединение (VI) - я виде растворе в 10Х-ном водном спирте. Принятые я табяице сокращения в/в - внутри(5рхя11ннио, в/м - в мозг..

.Редактор В, Иванова

Составитель А. Андриевский

Техред Н.БонкалоКорректор С.Черни

Заказ 2032Тираж 343 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР.

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5

Производственно-полиграфичаское предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Нитроксильные производные нитро- зомочевины общей формулы : R,(CHj)NR,C(0)N(NO)R, где ;- R,R, R,H, ,, n О (I);, R R, , ,CH,C1, (II); R,R4, R,H, R3 CHjCHjCl, (III); R,R5, R,H, ,CHiCl, (IV); R -R, R,CH3, ,Cl, (V); R,Rg, , ,CH,C1, (VI); НзССНз , Rr-V/N-O, R5 „Хтн WOOC Нзс CHj проявляющие противоопухолевую и муРНз НзС СНз N-0 )-0 СНз НзС СНз тагенную активность. § (Л С 1C ел СО 05 ел