Способ получения глюкозоизомеразы Советский патент 1982 года по МПК C12N9/92 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению ферментных препаратов, и может быть использовано в крахмало-паточной и гидролизной промышленностях для получения фруктозосодержащих сиропов из глюкозы, полученной путем гидролиза крахмало- или целлюлозосодержащего сырья. Известен способ получения глюкозоизомеразы путем культивирования микроорганизмов рода Streptomyces на питательных средах, содержащих в качестве активатора биосинтеза фермента глицин и нитрат аммония (по 0,50/0) 1. Недостатками способа являются невысокий уровень продуктивности биомассы по глюкозоизомеразе, а также использование дорогостоящего реактива - глицина, что значительно увеличивает стоимость получаемых препаратов глюкозоизомеразы. Также известен способ получения глюкозоизомеразы, предусматривающий культивирование .микроорганизмов рода Streptomyces на питательных средах, содержащих источники углерода, азота, минеральные соли и индуктор биосинтеза глюкозоизомеразы, при температуре 30°С и перемешивании с последующим отделением биомассы, где в качестве индуктора используют Д-сорбит в концентрации 1,0 вес.°/о 2. Основным недостатком прототипа является недостаточная эффективность Д-сорбита, используемого в качестве вещества, активирующего биосинтез глюкозоизомеразы, так как он увеличивает продуктивность культуры по глюкозоизомеразе только на 10-15%, что является недостаточно высоким показателем. Кроме этого, концентрация вносимого в среду активатора достаточно высока, что приводит к удорожанию питательной среды, а значит, и получаемого препарата глюкозоизомеразы. Цель изобретения - увеличение продуктивности микроорганизмов по глюкозоизомеразе. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения глюкозоизомеразы, предусматривающему культивирование микроорганизмов рода Streptornyces на питательных средах, содержащих источники углерода, азота, минеральные соли

и индуктор биосинтеза глюкозоизомеразы, при температуре 30° и перемешивании с последующим отделением биомассы, в качестве индуктора используют Д-ксилит в концентрации 0,01 -1,0% от среды.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Культуру Streptomyces albogriseoius 28-3 (ВКМ А-588) выращивали в колбах емкостью 700 мл, содержащих по 35 мл питательной среды следующего состава, %: Д-ксилоза 1,0; пептон 1,0; дрожжевой экстракт 1,0; KiHPO, 0,3; 7; H, 0,1; агар-агар 0,1- Исходный рН питательной среды до стерилизации 7,2. Продолжительность стерилизации 30 мин при 0,5 ати. Засев проводят споровой суспензией, полученной путем смыва воздущного мицелия стерильной водой с культуры, выращенной на скощенной агаризованной среде. Культивирование ведут на круговой качалке при п 200 об/мин, 30° в течение 40 ч. Выращенный инокулят используют дли засева колб емкостью 750 мл, содержащих по 50 мл среды вышеописанного состава, в которую вместо Д-ксилозы вносили Дксилит или Д-сорбит в концентрации 1,0 вес. %. Доза засева составляет 10 об. %. Исходный рН сред до стерилизации 7,2. Продолжительность стерилизации 30 мин при 0,5 ати. Культивирование вели в течение 24 ч на круговой качалке при п 200 об/мин, 30°. После окончания культивирования выращенную культуру центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин (центрифуга ЦЛС-ЗМ). В полученном супернатанте определяли значение рН, а осадок дважды промывали дистиллированной водой для удаления остатков питательной среды. Промытую биомассу используют для определения глюкозоизомеразной активности. Для этого готовят изомеразационную смесь следующего состава: Д-фруктоза 2,0 М; МдЗОдХ X 5-10-3 М, фосфатный буфер рН 7,0 0,05 М. К 5 мл изомеризационной смеси, термостатированной при 70° в водяной бане, добавляют примерно 100 мг влажной биомассы продуцента. Полученную суспензию термостатируют при постоянном перемешивании в течение 30 мин при 70°, после чего колбочку с суспензией охлаждают в ледяной бане для остановки реакции изомеризации. Количество образовавщейся Д-глюкозы определяют автоматически на глюкозном анализаторе фирмы «Beckman. За единицу активности (МГлИЕ) принимают количество фермента, необходимого для получения 1 мм Д-глюкозы из Д-фруктозы в минуту при 70° и описанных выше условиях изомеризации. Расчет продуктивности штамма по глюкозоизомеразе ведут, подсчитывая количество МГлИЕ, полученных с литра питательной среды.

Результаты определения активности глюкозоизомеразы и продуктивности культуры, полученные после культивирования штамма Streptomyces albogriseolus 28-3 на питательной среде, содержащей Д-ксилит, в сравнении с другими углевода ми приведены в табл. 1. Из данных табл. 1 следует, что добавление в питательную среду Д-сорбита приводит к увеличению продуктивности культуры по глюкозоизомеразе - на 13%, а внесение Д-ксилита в той же концентрации увеличивает продуктивность культуры по глюкозоизомеразе на 65%.

Пример 2. Получение биомассы и определение активности глюкозоизомеразы проводят так, как это описано в примере 1. Па стадии ферментации используют питательные среды, составы которых приведены в табл. 2. Исходный рП сред № 1-4 до стерилизации составляет 7,0, а среды № 5 6,2. Результаты определения продуктивности мицелия, полученного при культивировании на этих средах в присутствии 0,1 вес. % Д-ксилита и без него, представлены также в табл. 2. Как можно видеть, внесение Д-ксилита даже в концентрации

5 0,1 вес.% оказывает значительное стимулирующее влияние на биосинтез глюкозоизомеразы. Продуктивность культуры по глюкозоизомеразе увеличивается в зависимости от состава питательной среды в 2-10 раз.

Пример 3. Получение биомассы и определение активности проводят так, как это описано в примере 1. Па стадии ферментации используют питательные среды № 1-5 (табл. 2, пример 2), в которые вносят ДJ ксилит в концентрациях от 0,01 до 0,2-0,3 вес. %. Результаты определения продуктивности мицелия по глюкозоизомеразе представлены в табл. 3.

Анализ результатов позволяет сделать вывод о том, что насыщающей концентрацией Д-ксилита является концентрация 0,1 - 0,2 вес.%. Снижение концентрации Д-ксилита Ниже 0,01% не выгодно из-за незначительности оказываемого стимулирующего эффекта, увеличение же концентрации Дj ксилита выше 1,0 вес.% невыгодно из-за возрастания стоимости питательной среды без соответственного увеличения сти.мулирующего эффекта.

Применение предлагаемого способа получения глюкозоизомеразы позволяет в

0 2-10 раз увеличить продуктивность биосинтеза глюкозоизомеразы. Кроме того, ввиду Невысокой стоимости Д-ксилита (2 руб/кг) и малой концентрацией его в питательной среде себестоимость единицы активности глюкозоизомеразы остается

прежней или снижается.

Продуктивность культуры продуцента на средах с различными углеводами-индукторами Продуктивность

6

Табли биомассы и синтез фермента при культивировании на средах различного состава с внесением и без внесения Д-силиката Таблица 2

Влияние Д-ксилита в концентрации 0,01-0,3 на синтез iлюкозоизомеразы и продуктивность биомассы

ТаблицаЗ