СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ БИОСИНТЕЗА АНТИБИОТИКОВ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/38 C12P1/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства антибиотиков микробиологическим методом.

Антибиотики являются одним из самых крупнотоннажных продуктов биотехнологического производства и повышение его рентабельности до настоящего времени остается актуальным вопросом.

Основные направления совершенствования технологии производства антибиотиков связаны с оптимизацией условий культивирования соответствующих микроорганизмов-продуцентов, включая оптимизацию состава культуральной среды, и с изысканием штаммов-продуцентов с повышенной продуктивностью [Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках М.: Высшая школа, 1998. - 517 с.].

Вместе с тем, перспективным, по мнению заявителя, является направление интенсификации процесса антибиотикообразования микроорганизмами за счет воздействия на культуру-продуцент активаторами антибиотикообразования.

В этой связи цель настоящего изобретения состояла в изыскании соединений, способных активизировать биосинтез антибиотиков.

Поставленная цель была достигнута при использовании в качестве активатора антибиотикообразования натриевой соли [поли-(2,5-ди-гидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты.

Упомянутое соединение ранее под названием "Олифен", а в настоящее время под названием "Гипоксен" разрешено в установленном порядке к использованию в медицинской практике в качестве антигипоксического средства [Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. Издание восьмое. М., "РЛС-2001", 2001 г., стр.231].

К настоящему времени накоплен достаточный опыт, свидетельствующий о том, что многие заболевания и патологические состояния порождаются или сопровождаются гипоксией соответствующей ткани, о чем, в частности, свидетельствует высокая эффективность Гипоксена при широком круге патологий.

В частности, натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4- тиосульфокислоты запатентована в качестве лечебного препарата для коррекции патологических состояний, связанных с нарушениями метаболитических процессов [Патент РФ 2124888, 1999 г.].

Это соединение показало эффективность при лечении рассеянного склероза [Описание изобретения к заявке 94-037731, 1996 г.], острого деструктивного панкреатита [Патент РФ 2139048, 1999 г.], хронических неспецифических заболеваний легких [Патент РФ 2043765, 1995 г.] и в других случаях.

Было показано, что натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]- 4-тиосульфокислоты стимулирует пролиферацию клеток ВНК-21, увеличивая накопление клеток приблизительно на 25%.

Введение натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]- 4-тиосульфокислоты в состав посевной среды для выращивания производственного штамма Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты дает увеличение съема лимонной кислоты на 21%, экономию мелассы на 9% и сокращение производственного цикла на 10% [Патент РФ 2105000, 1998 г.].

Исходя из известных свойств натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси- фенилен)]-4-тиосульфокислоты, способность этой соли активизировать процесс антибиотикообразования у микроорганизмов априорно и однозначно не вытекает.

Это соединение не является в то же время предшественником или структурным аналогом тех антибиотиков, биосинтез которых оно стимулирует.

Существо предложенного способа состоит в том, что выращивание культуры-продуцента соответствующего антибиотика проводят в присутствии натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты.

При этом, эффективная концентрация натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты в культуральной среде составляет обычно 2-10 мкг/мл и предпочтительно лежит в пределах от 4 до 8 мкг/мл.

На фиг. 1 и 2 показано влияние концентрации натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты на синтез пенициллина и стрептомицина, соответственно.

Для биосинтеза пенициллина культуру Penicillium chrysogenum выращивали на качалке в колбах емкостью 750 мл, содержащих в расчете на 1 л среды: 50 мл кукурузного экстракта, 40 г глюкозы, 0,5 г однозамещенного фосфата калия, 3 г нитрата натрия, 0,125 г сульфата магния, 5 г углекислого кальция. Культивирование осуществляли при температуре 25^oC в течение 7 суток. Стимулятор в разных концентрациях вносили через 24 ч после начала культивирования.

Для биосинтеза стрептомицина культуру Streptomycea griseus выращивали на качалке в колбах емкостью 750 мл, содержащих по 50 мл культуральной среды. Культивирование осуществляли при температуре 28-30^oC в течение 7 суток. Стимулятор в разных концентрациях вносили через 24 ч после начала культивирования.

Из представленных данных видно, что максимальный стимулирующий эффект на биосинтез пенициллина проявился при концентрации натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты, равной 4 мкг/мл, и при увеличении ее концентрации заметно снижался. Максимальный уровень накопления пенициллина превышал уровень накопления пенициллина в контрольном варианте в 4 раза.

Максимальное накопление в культуральной жидкости стрептомицина достигалось при концентрации натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты, равной 8 мкг/мл, и такой уровень превышал уровень накопления этого антибиотика в контрольном опыте на 70%.

Одновременно натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4 -тиосульфокислоты стимулировала синтез биомассы продуцента. Однако, максимум накопления биомассы продуцента пенициллина наблюдался при концентрации активатора несколько более высокой, чем та, которая максимально стимулирует синтез антибиотика - 6 мкг/мл против 4 мкг/мл (фиг. 3), а максимум накопления биомассы продуцента стрептомицина - при более низкой - 4 мкг/мл против 8 мкг/мл (фиг.4).

Применение натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4- тиосульфокислоты для стимулирования биосинтеза стрептомицином производственным штаммом Streptomyces griseus C-7 в лабораторных условиях показало, что при внесении этой соли в культуральную среду в концентрации 5 мкг/мл через 24 ч после начала культивирования, имело место увеличение накопления антибиотика на 12-33% по сравнению с контролем.

В лабораторных условиях было показано, что внесение натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты в концентрации 5 мкг/мл в культуральную жидкость Streptomyces coeruborubidus - продуцента рубомицина через 24 ч после начала культивирования привело к повышению накопления антибиотика на 20-27% по отношению к контролю.

При конечной концентрации натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси- фенилен)] -4-тиосульфокислоты в культуральной жидкости продуцента рифамицина B Amycolatopsis mediterraney P-91, равной 10 мкг/мл, прирост накопления антибиотика на 9 суток культивирования составлял 6-7% по сравнению с контролем.

Таким образом, позитивное влияние натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты на процесс синтеза антибиотиков подверждается при ее воздействии на культуры-продуценты, относящиеся к разным таксономическим группам.

Этот активатор антибиотикообразования может быть внесен непосредственно в исходную питательную среду, но рациональнее его вносить в процессе культивирования, по крайней мере, через 24 ч от начала культивирования.

Натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты при необходимости может вноситься и в состав посевной среды.

Следующие примеры, не имеющие ограничивающего характера, иллюстрируют сущность предложенного способа.

Пример 1. Для получения пенициллина музейную культуру Penicillium chrysogenum выращивали на ферментационной среде, содержащей, в г/л: кукурузный экстракт (20,0), глюкозу (40,0), однозамещенный фосфат калия (0,5), нитрат натрия (3,0), сульфат магния (0,125), углекислый кальций (5,0). Значение pH среды до стерилизации было равным 6,0.

Культивирование осуществляли в колбах емкостью 750 мл, в которые заливали по 50 мл среды, в течение 7 суток при температуре 25^oC на круговой качалке, делающей 180 об/мин.

Посевным материалом служил 40-часовой мицелий, который вносили в ферментационную среду в количестве 10%. Всего было засеяно 40 колб.

Через 24 ч после начала культивирования в 30 колб было внесено по 1 мл 0,02 %-ного раствора натриевой соли [поли- (2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты. В 10 колб, являющихся контрольными, эта соль не вносилась.

По завершении процесса содержание антибиотика в среднем составляло в контрольных образцах 5800 ед./мл, а в опытных образцах 23000 ед./мл, что на 400% выше, чем в контроле.

Пример 2. Для получения стрептомицина промышленную культуру Streptomyces griseus C-7 выращивали на ферментационной среде, содержащей, г/л: глюкозу (40,0), кукурузный экстракт (40,0), нитрат калия (8,0), однозамещенный фосфат калия (1,0), хлористый калий (0,5), сернокислый магний (0,5), углекислый кальций (5,0).

Значение pH среды до стерилизации было равным 6,0.

Культивирование осуществляли в колбах емкостью 750 мл, в которые заливали по 40 мл среды, в течение 7 суток при температуре 28^oC на круговой качалке, делающей 180 об/мин.

Посевным материалом служил 40-часовой мицелий, который вносили в ферментационную среду в количестве 10 об.%. Всего было засеяно 40 колб.

Через 24 ч после начала культивирования в 30 колб было внесено по 1.6 мл 0,02%-ного раствора натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4- тиосульфокислоты. В 10 колб, являющихся контрольными, эта соль не вносилась.

По завершении процесса содержание антибиотика в среднем составляло в контрольных образцах 4300 ед./мл, а в опытных образцах 7100 ед./мл, что на 65% выше, чем в контроле.

Пример 3. Для получения рубомицина музейную культуру Streptomyces coeruborubidus выращивали на стандартной ферментационной среде.

Значение pH среды до стерилизации было равным 6,0.

Культивирование осуществляли в колбах емкостью 750 мл, в которые заливали по 50 мл среды, в течение 7 суток при температуре 30^oC на круговой качалке, делающей 180 об/мин.

Посевным материалом служила двухсуточная вегетативная культура, которую вносили в ферментационную среду в количестве 3 об.%. Было засеяно 40 колб.

Через 24 ч после начала культивирования в 30 колб было внесено по 1 мл 0,02%-ного раствора натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси- фенилен)]-4-тиосульфокислоты. В 10 колб, являющихся контрольными, эта соль не вносилась.

По завершении процесса содержание антибиотика в среднем составляло в контрольных образцах 200 ед./мл, а в опытных образцах 320 ед./мл, что на 60% выше, чем в контроле.

Пример 4. Для получения рифамицина В промышленную культуру Amycolatopsis mеditerraney P-91 выращивали на ферментационной среде, содержащей, г/л: соевую муку (40,0), глюкозу (40,0), нитрат калия (8,0), сернокислый магний (0,5), углекислый кальций (5,0). Значение pH среды до стерилизации было равным 6,0.

Культивирование осуществляли в колбах емкостью 750 мл, в которые заливали по 50 мл среды, в течение 9 суток при температуре 25^oC на круговой качалке, делающей 180 об/мин.

Посевным материалом служил вегетативный мицелий, который вносили в ферментационную среду в количестве 10 об.%. Было засеяно 40 колб.

Через 24 ч после начала культивирования в 30 колб было внесено по 2 мл 0,02 %-ного раствора натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты. В 10 колб, являющихся контрольными, эта соль не вносилась.

По завершении процесса содержание антибиотика в среднем составляло в контрольных образцах 14800 мкг/мл, а в опытных образцах 15680 мг/мл, что на 5,9% выше, чем в контроле.

Есть основания полагать, что натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси- фенилен)] -4-тиосульфокислоты способна устранять и/или ослаблять влияние некоторых лимитирующих факторов, не позволяющих в полной мере реализовываться потенциям продуцентов.

Это обстоятельство косвенно подтверждается тем фактом, что повышение биосинтеза антибиотиков натриевой солью [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты в меньшей степени проявляется при выращивании высокоактивных штаммов-продуцентов в промышленных условиях, когда потребности продуцента исследованы и удовлетворены в максимально возможной степени.

Иными словами, если условия культивирования штамма-продуцента, включая состав культуральной среды и режимы выращивания, соответствуют полным потребностям культуры, то влияния лимитирующих факторов на биосинтез антибиотика не имеет места (что возможно лишь теоретически) или оно сказывается минимальным образом. В этих условиях стимулирование антибиотикообразования натриевой солью [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты хотя и минимально, но, учитывая практически максимально достижимый уровень продуктивности штамма, весьма значимо.

В остальных случаях, когда потребности продуцента удовлетворяются весьма неполностью, стимулирующее влияние натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты проявляется в значительно более высокой степени.

Можно допустить, что выраженность стимулирующей антибиотикообразование активности упомянутой натриевой соли может быть пропорциональна степени выраженности проявления лимитирующих факторов на процесс биосинтеза антибиотика.

С этой точки зрения высокий процент повышения антибиотической активности культуральной жидкости, вызываемый натриевой солью [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты, означает, что продуцирующей культуре не созданы оптимальные для биосинтеза антибиотика условия и их следует совершенствовать.

Следовательно, в условиях недостаточной изученности физиологических потребностей культуры-продуцента применение натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты в качестве стимулятора антибиотикообразования позволяет не только интенсифицировать процесс антибиотикообразования, но и выявить скрытые потенции штамма-продуцента.

Кроме общебиологических представлений о существовании класса биорегуляторов, способных влиять на биологические процессы в живой клетке, заявитель не располагает какой-либо информацией об известности или практическом использовании химических соединений или биологических продуктов, способных неспецифически активизировать процессы антибиотикообразования у культур-продуцентов разных таксономических групп.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства антибиотиков микробиологическим методом. Культуру-продуцент выращивают в присутствии стимулятора натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]- 4-тиосульфокислоты. Стимулятор вносят в концентрации 2-10 мкг/мл после 24 ч от начала выращивания. В качестве культуры-продуцента может быть использован продуцент пенициллина, продуцент стрептомицина, продуцент рифамицина В или продуцент рубомицина. Способ позволяет повысить интенсивность антибиотикообразования. 6 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ стимулирования биосинтеза антибиотиков, характеризующийся тем, что культуру-продуцент выращивают в присутствии натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты как стимулятора антибиотикообразования. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуру-продуцент выращивают в присутствии натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты при ее концентрации 2-10 мкг/мл. 3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что культуру-продуцент выращивают в присутствии натриевой соли [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)] -4-тиосульфокислоты, вносимой после 24 часов от начала выращивания. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве культуры-продуцента используют продуцент пенициллина. 5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве культуры-продуцента используют продуцент стрептомицина. 6. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве культуры-продуцента используют продуцент рифамицина В. 7. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве культуры-продуцента используют продуцент рубомицина.