Способ получения фосфолипазы Д Советский патент 1983 года по МПК C12N9/20 C12N15/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ Д

1 Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству ферментов, и преаставляД ет собой способ получения фермента фоофолипазы Д. Известен способ получения фосфолипаз Д из 5trep,tom: сез сЪотоЕизсиз.Для культивирования микроорганизмов используют среду следующего состава, г/л: лактоза. 2О, протофлор 2О и неоргани- ческие соли, рН 7,2, Микроорганизмы выращивают аэробно в 20-литровых ферментерах при в течение 45 ч. Активность фосфолипазы Д в культуральной жидкости 0,5 мкмоль холина/млМин удельная активность 0,15 мкмольхоли- на/мг белка при использовании в качест ве субстрата лецитина tl3 Недостатком данного способа является низкая активность целевого продукта. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения фосфолипазы Д из Streptcm-sces liacliijoBi 5is(5treptoveriiCi EiUTn)и штамм IFO 12782, Микроорганизмы выращивают ;В аэробных условиях при перемешивании ЗОО об/мин, температуре в тече ние четырех дней в 50О-миллилитровых эрленмейеровских колбах, содержащих 1ОО мл питательной среды следующего состава, г/л: полипептон 7,5;мясной экстракт 7,5,- растворимый крахмал 10,ЫаСеЗ; Mq SO -lHgOlO. При этом активность фермента достигает 12,1 мкмоль этаноламина/мл- мин с удельной акти& ностью 1,1 ед/мг белка 12. Недостатком этого способа является невысокая активность фермента в культуральной жидкости и низкая удельная активность. Кроме того, компоненты питательной среды (полипептон, и мясной экстракт) являются дефицитными и дорогостоящими, а их хранениеСвязано с дополнительными затратами, так как требует низких температур, что отражается на стоимости продукта. 398 Цель изобретения - повышение ферментативной активности в купьтуральной жидкости целевого продукта и снижение его себестоимости. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения фосфоли- пазы Д, включающему культивирование продуцирующего микроорганизма рода StreptoverticieEiom на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и врду, в качестве продуцирующего микроорганизма из рода streptoverticieftum используют щтамм StreptoverticiBPium cimnatnomeom 1102С, а культивирование ведут на питательной среде следующего состава, г/л: 2О,О-30,О Соевая муКа 1,0 -20,0 Фруктоза Оцнозамещен- ный фосфорно- . Кислый калий0,5 -2,0 Хлористый аммоний2,0-3,0 Предлагаемый в качестве продуцента штамм StreptoverticiBium cinnamoTneum 11О2С (Ssn-Strepiom ces cinrioiTnonwws) ранее использовался в качестве продуцента антибиотиков. Штамм депонирован в коллекции ВНИИ антибиотиков, г. Москва, коллекционный номер 1652. Пример. Лабораторный способ получения фосфолипазы Д из StreptoVeriicifcgiutn вида cinnamomeuTm штамма 1102 С.Л- Способ включает три этапа поддерживания кyльтypы..Streptovвг CiвP1 im cinna momeum штамм 11О2С в пробирках приготовление посевного материала в колбах, культивирование Sirepto iBrtici Eto cinncsmoroeutn штамм 1102 С в колбах Поддерживание культуры StreptoverticiBBium cinnamomeorrj штамм 1102С. Культуру S-tneptoverticiBEiOTn cinncimomeom штамм 11б2С поддерисиварт в пробирках на косяках агаризованной среды следующего состава, г/л: СаСО, KNO О,67; (SO -THjO O,35;NaCCO,35; KiHP04Р,53, глюкоза 14; агар 20. Среду без фосфата и глюкозы разливают в пробирки размером мм по 13 мл и стерилизуют 30 мин при 0,9 атм. Растворы фосфатов (0,8%) и глюкозы (21%) стерилизуют отдельно (фосфаты при 0,8 атм 30 мин глюкозу при 0,5 атм ЗО мин) и стерильно заливакуг по i мл в пробирки с незастывшей питательной средой. Культуру выращиваю 3 термостате при 30°С в течение двух недель и используют для получения посевного материала. Приготовленная таким образом культура StfeptoverticiPPiom 1ппатотеитштамм 11О2С пригодна к употреблению в течение 2 мес при хранении при + 4°С. Приготовление посевного материала. Посевной материал выращивают в колбах на среде следующего состава, г/л: соевая мука ЗО; фруктоза 1; KH,jPO.2; (NH4 )504 - Р раствора соевой муки и (NH4)S04 доводят до 7,21н. раствором КОН, разливают по 50 мл в колбы емкостью 750 мл и стерилизуют при 0,9 атм 30 мин. Отдельно готовят 20%ньй раствор КН„РО. и 1О%-ный раствор фруктозы, стерилизуют 30 мин при 0,8 и 0,5 атм соответственно и добавляют в среду по 0,5 мл непосредственно перед засевом. Посевной материал выращивают в условиях перемешивания на круговой качалке (180-20О об/мин) при в течение 24 ч. Приготовленный таким образом посевной материал служит в качестве инокулята для культивирования продуцента фосфолипазы Д. Культивирование StreptoverticiPBivjm cinnamomeum штамм 1102С в колбах. Для получения фосфолипазы Д продуцент культивируют в колбах на среде следующего состава, г/л: соевая мука 3Pi фруктоза I; KH2PQ 2; . рН раствора соевой муки доводят до 7,2 1н. раствором КОН, разливают в колбы емкостью 75О мл по 5О мл и стерилизуют при 0,9 атм ЗО мин, 10%ный раствор фруктозы и 2О%-ный раствор KHjjPO готовят отдельно, стерилизуют при 0,5 и 0,8 атм соответственно 30 мин .1 и стерильно добавляют по 0,5 мл в каждую колбу непосредственно перед засевом. Засев проводят, добавляя в каждую колбу по 1 мл инокулята. Микроорганизмы выращивают в течение 48 ч при и перемешивании 180-200 об/мин. Максимальное накопление фосфолипазы Д в культуральной жидкости наблюдают к 48-му часу культивирования. Фильтрат полученной таким образом культуральной жидкости содержит фосфолипазу Д с активностью 29 ед/мл и удельной активностью 99 ед/мг белка. В таблице приведены сравнительные данные получения фосфолипазы Д по предлагаемому способу и прототипу при объеме фильтрата культурапьнсй жидкости 300 мл..