ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и селекции гриба Aspergillus niger -продуцента лимонной кислоты для ферментации глубинным способом сред: сахарно-минеральных и полученных в результате гидролиза крахмала, содержащих различное количество глюкозы.

Известен природный штамм гриба Asp. niger 82(Д) продуцент лимонной кислоты для ферментации сахарозо-минеральных сред. За 10 сут ферментации штамм образует 50-60% лимонной кислоты от затраченного сахара (1). При культивировании на сусло-агаре штамм 82(Д) обильно образует черно-окрашенные конидии размером 4,3 мкм.

Известен продуцент лимонной кислоты Asp. niger S-59 (из коллекции микроорганизмов CCF 1600) для глубинного культивирования на питательной среде, содержащей 15% сахарозы. После 7 сут ферментации выход лимонной кислоты достигает 70 75% от внесенного сахара (2).

Недостатком известных штаммов 82(Д) и S-59 является сравнительно низкая продуктивность при длительной ферментации.

Прототипом изобретения может служить известный штамм Asp. niger ВКПМF-501, предназначенный для глубинного культивирования на сахарозо-минеральных средах, образующий лимонную кислоту с выходом от сахара 82,5% Штамм имеет бежевую окраску конидий (3).

Недостатком штамма ВКПМF-501 является его мощный рост, требующий значительных затрат сахара на формирование биомассы в ущерб образующейся лимонной кислоте. Из-за обильного роста выход лимонной кислоты от затраченного сахара у культур штамма ВКПМF-501 недостаточно высокий.

Технический результат изобретения получение нового штамма Asp. niger, обладающего более высокой продуктивностью по образованию лимонной кислоты при ферментации глубинным способом питательных сред, в которых источником углерода является сахароза или смесь сахаров с содержанием глюкозы от 15 до 75%
Исходным объектом для получения нового штамма путем селекции служил черно-окрашенный вариант Asp. niger 163/9 из коллекции ВНИИПАКК. Типичная форма 163/9 при выращивании на сахарозо-минеральной среде продуцирует 4,5 г лимонной кислоты на колбу, выход лимонной кислоты от сахара -56%
Для получения нового высокопродуктивного штамма Asp. niger осуществили ступенчатую селекцию, состоящую из пяти этапов. Для индуцирования и селекции мутантов исходные культуры подвергали воздействию ультрафиолетовых лучей. Для стабилизации свойств селекционированных мутантов проводили отбор устойчивых спонтанных вариантов. Основанием для селекции активных мутантов и спонтанных вариантов служили результаты ферментации сахарозо-минеральных сред и питательных растворов, приготовленных из карамельной патоки и гидролизата крахмала; одновременно исследовали устойчивость морфолого-культуральных свойств у селекционированных штаммов.

Новому селекционированному штамму Aspergillus niger во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов присвоен коллекционный номер ВКПМF-681.

КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВОГО ШТАММА ВКПМF-681 Aspergillus niger
На 5 сутки роста на сусло-агаре гигантская колония диаметром 90 мм. Колония черно-окрашенная. В радиусе 10 мм конидиеношение обильное. На остальной части колонии конидиальные головки образуются группами, не очень плотно. "Стерильный" край колонии с незрелыми конидиальными головками около 5 мм. С подошвы колония в ее центре плотная, периферическая часть колонии имеет тонкий мицелий.

После 10 сут выращивания на сусло-агаре культура характеризуется обильным созреванием конидий. Конидиальные головки от 54х54 мкм до 180х234 мкм в диаметре, в среднем 119 мкм. Вздутия конидиеносцев 34-39 мкм шаровидной или продольно вытянутой формы. Стеригмы двухслойные. Длина стеригм первого слоя 9х2,3 11,5х4,6 мкм; длина стеригмы второго слоя 4,6 мкм. Конидии округлые, диаметр их сечения 3,4-4,6 мкм, в среднем 3,99 мкм. Оболочка серая, имеет множество шипов. Конидиеносцы прямые, длина их 240-1000 мкм; средняя длина 450 мкм. Поперечное сечение конидиеносцев 19-34 мкм; в среднем 29 мкм.

Конидиеносцы неокрашенные, темно-коричневый пигмент накапливается в верхней части конидиеносца, прилегающей к пузырьку.

По сравнению с родительским штаммом 82 и исходным 163/9 новый штамм имеет меньшую величину морфологических структур (длина конидиеносцев, вздутие конидиеносцев, стеригмы второго слоя, конидии): от прототипа бежевого штамма ВКПМ-501 отличается темно-серой окраской конидий.

Штамм Asp. niger ВКПМF-681 идентифицирован по Определителю грибов рода Аспергиллус (4).

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Aspergillus Niger ВКПМF-581
Аэроб, температура культивирования 28-32^oC, pH 5,5 7,5.

Отношение к источникам углерода: усваивает глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, в меньшей степени маннит, галактозу, сорбит.

Отношение к источникам азота: усваивает азот органических соединений, например, белок, пептон, аминокислоты, дрожжевой автолизат, мочевину, ассимилирует соли аммония, нитраты.

Способ хранения. Новый штамм хранится в виде воздушно-сухих конидий, отделенных от культуры гриба, выращенной на сусло-агаре в течение 10 сут (6-7 сут при 32^oC и 3-4 сут при комнатной температуре), предохраняется от воздействия прямых солнечных лучей.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСОБЕННОСТЬ ШТАММА-ПРОТОТРОФ
Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма ВКПМF-681.

Пример 1. Для лабораторных испытаний посевной материал выращивают в пробирках на сусло-агаре; для полупроизводственных и производственных испытаний посевной материал выращивают в кюветах на плотной питательной среде, приготовленной на основе пивного неохмеленного сусла, содержащего 7% сухих веществ и уплотненной агар-агаром (20 г/дм³), pH среды 5,8. Высота слоя среды 12 13 мм. Стерильную среду засевают конидиями элитной культуры гриба и выдерживают в термостате при 32^oC в течение 7 сут. Относительная влажность воздуха в термостате постепенно снижается: первые четверо сут от 80 до 60% последние трое суток от 60 до 40% Для полного созревания культуру гриба выдерживают при комнатной температуре в течение 2 сут. Через 9-10 сут конидии снимают с поверхности грибных пленок при помощи специального вакуумного устройства.

Влажные конидии подсушивают до остаточной влажности 5 8% Хранят при комнатной температуре.

Процесс ферментации в лабораторных условиях проводят глубинным способом на качалке АВУ-50р с числом качаний 160-180 в мин. Температура воздуха в качалочной комнате 32^oC.

Питательные среды приготавливают в колбах емкостью 750 мл; объем среды 50 мл.

Культурой гриба, выращенной на сусло-агаре в течение 10 сут или воздушно-сухими конидиями (10⁷ конидий/см³ среды), засевают питательную среду и в течение 2 сут выращивают посевной мицелий, Температура воздуха в термокамере 30-32^oC.

Основным сырьем для приготовления сред в данном примере является сахарный песок.

Состав питательной среды (г/л): сахар 50, меласса свекловичная 17, нитрат аммония 2,5, сульфат магния семиводный 0,25, дигидрофосфат калия 0,16, водопроводная вода до 1 л, pH 5,0 5,5.

Подросшим мицелиям в количестве 10 мл засевают 50 мл ферментационной среды. Состав ферментационной среды отличается от состава питательной среды увеличенным до 150 г/л содержанием сахара. В процессе ферментации подпитка культуры не производится. Всего на выращивание посевного мицелия и на ферментацию затрачивается 8,0 г сахара. Среды стерилизуются в автоклаве текучим паром 15 мин и при 0,5 атм 30 мин. Накопление лимонной кислоты определяется с использованием методов, изложенных в Инструкции по биохимическому и химическому контролю производства пищевой лимонной кислоты, Л. 1972г.

За 5 сут ферментации из 8 г сахара образуется 7,18 г кислот, в том числе 99,2% лимонной кислоты и 0,8% глюконовой кислоты; съем лимонной кислоты с дм³/сут 23,7 г, выход лимонной кислоты от внесенного сахара 89,0%
Пример 2. Посевной материал нового штамма заготавливается по способу, описанному в примере 1, основным сырьем для приготовления ферментационных сред в данном примере является карамельная патока, содержащая глюкозу, мальтозу, декстрины (сумма ферментируемых сахаров 69,8% содержание глюкозы 15%). Из конидий гриба в течение 2 сут в глубинных условиях на качалке АВУ-50р выращивается посевной мицелий на питательной среде состава, г/л: карамельная патока 71,6, нитрат аммония 2,5, сульфат магния семиводный 0,25, дигидрофосфат калия 0,16, водопроводная вода до 1 л.

Подросшим мицелиям в количестве 10 мл засевают 50 мл ферментационной среды, приготовленной в колбах емкостью 750 мл. Состав ферментационной среды (г/л): карамельная патока (содержание глюкозы в смеси сахаров 15%) 171,9, нитрат аммония 1,6, сульфат магния семиводный 0,25, дигидрофосфат калия 0,16, сернокислый цинк 0,005. Водопроводная вода до 1 л. Среды стерилизуют 15 мин текучим паром и 20 мин при 0,5 атм. На выращивание посевного мицелия и ферментацию затрачивается 6,5 г сахара. Через 5 сут ферментации в среде накапливается 6,01 г лимонной кислоты. Выход лимонной кислоты от сахара 92,5% Съем лимонной кислоты с 1 дм³/сут 20,0 г.

Пример 3. Посевной материал нового штамма заготавливается по способу, описанному в примере 1. Культивирование проводится на качалке в тех же условиях. Основным сырьем для приготовления ферментационных сред в данном примере является карамельная патока. Посевной мицелий выращивается на среде состава, данного в примере 2. Подросшим мицелием в количестве 10 мл засевают 50 мл ферментационной среды. Состав ферментационной среды отличается от приведенного в примере 2 увеличенным содержанием сахара: расход сахара на цикл 7,5 г. Через 5 сут ферментация в среде накапливается 6,9 г кислоты. В сумме кислот лимонная кислота составляет 99,39% глюконовая 0,61% Съем лимонной кислоты в пересчете на 1 дм³/сут 22,9 г, выход лимонной кислоты от сахара 91,5%
Пример 4. Посевной материал нового штамма заготавливается по способу описанному в примере 1. Сырьем для приготовления ферментационных сред в примере 3 является гидролизат крахмала, содержание глюкозы 74,9% Посевной мицелий гриба выращивается на качалке АВУ-50р в течение 2 сут на среде состава (г/л): гидролизат крахмала 67, нитрат аммония 2,5% дигидрофосфат калия 0,16, сульфат магния семиводный 0,25, цинк сернокислотный 0,005, вода водопроводная до 1 л. Посевной мицелий в количестве 10 мл вносят в ферментационную среду состава (г/л): гидролизат крахмала 94, нитрат аммония 1,6, дигидрофосфат калия 0,16, сульфат магния семиводный 0,25, цинк сернокислый 0,005. Исходный объем ферментационной среды 50 мл. Через сутки в ферментационную среду добавляют в два приема 25%-ный раствор гидролизата крахмала в количестве 24 мл. Расход сахара на колбу 10 г. Питательная и ферментационная среды стерилизуются 15 мин текучим паром и 20 мин при 0,5 атм. Температура воздуха в термокамере 32^oC. Через 7 сут ферментации в ферментационной среде накапливается 8,4 г лимонной кислоты, выход лимонной кислоты из сахара 84%
Из приведенный примеров и прилагаемой таблицы видно, что новый штамм ВКПМF-681, выращенный на сахарозо-минеральных средах, существенно превосходит известные штаммы Asp. niger 82(Д), S-59 и ВКПМF-501 по съему лимонной кислоты с единицы объема среды в сутки и выходу лимонной кислоты от затраченного сахара. При культивировании на ферментационных средах, приготовленных из продуктов гидролиза крахмала, содержащих глюкозу, новый штамм значительно превосходит прототип штамм ВКПМF-501 по съему и выходу лимонной кислоты от сахара.

Большое преимущество нового штамма ограниченный рост и высокая продуктивность мицелия, достигающая 18,7 г лимонной кислоты на 1 г воздушно-сухого мицелия за 5 сут ферментации; щавелевую кислоту штамм не образует; массовая доля лимонной кислоты в сумме кислот составляет 94-99% выход лимонной кислоты от сахара затраченного на цикл 84-92,5% (см. табл.).

Новый штамм является достаточно универсальным и предлагается для ферментации сахарозо-минеральных сред и сред, полученных в результате гидролиза крахмала, содержащих от 15 до 75% глюкозы.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
Журавский Г.И. Глубинный способ производства лимонной кислоты. - Микробиология, 1955, т.XXIV. вып.3, с.332-340.

Патент 202709 ЧССР, кл. C 12 P 7/48. Zpusob vyroby kyseliny citronove submersnum zpusobem zkvasovanum cukernych roztoku pliseni Asp. niger. - Zerpold S. (ЧССР), Musilkova M. (ЧССР), Fencil Z. (ЧССР), Ujcova E. (ЧССР), опубл. 30.05.80.

Штамм гриба Asp. niger ВКПМF-501 продуцент лимонной кислоты. - В.М.Голубцова (СССР); В.П.Ермакова (СССР); Е.С.Минц (СССР); Т.А.Никифорова (СССР); А.В.Галкин (СССР); В.М.Финько (СССР); В.Н.Жданова (СССР).

Билай В.И. Коваль Э.З. The genus Asperilli -Киев. Наукова думка, 1988.

Использование: биотехнология, производство лимонной кислоты. Сущность изобретения: новый штамм продуцент лимонной кислоты - Aspergillus niger BKPMF-681. Штамм получен путем селекции, имеет черную окраску колоний, конидии диаметром 3,4-4,6 мкм. Отличается высокой продуктивностью биомассы, образует 11,8-18,7 г лимонной кислоты на 1 г воздушно-сухого мицелия. 1 табл.

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-681 продуцент лимонной кислоты.