Штамм SтарнуLососсUS SарRорнутIсUS L-1.10-продуцент уреазы Советский патент 1983 года по МПК C12N15/00 

(54) ШТАММ STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS U-1.10 ПРОДУЦЕНТ УРЕАЗЫ

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению нового штамма, используемого для получения фермента уреазы.

Продуцентами уреазы являются различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи, Т-микоплазмы, а также простейшие и растения. Наиболее распространенными продуцентами уреазы являются бактерии. Среди кокков, синтезирующих уреазу известен штамм Staphylococcus saprophyticus 1.

Недостатком данного штамма является низкая уреазная активность. При пересевах штамма Staphylococcus saprophyticus уровень биосинтеза уреазы снижался более, чем на 50%. Наиболее близким к предлагаемому по своим культурально-морфологическим, биохимическим и физиологическим свойствам является штамм Staphylococcus saprophyticus L-1 t2}.20

Однако известный штамм обладает недостаточно высокой уреазной активностью. Активность данного штамма на мг ацетонового

препарата клеток при культивировании в полупроизводственных условиях составляет в среднем 4,5, в колбах - 4,2 ёфницы.

Целью изобретения является получение нового штамма-продуцента уреазы с высокой и стабилыюй активностью в условиях глубинного культивирования.

Штамм Staphylococcus saprophyticus Ц-1.10 получен путем целевого селекционного отбора наиболее активных вариантов исходного штамма. С целью отбора возможных более активных вариантов исходного штамма. Sta- phytoqoccus saprophyticus i, -1 производили рассев бактериальной суспензии на агаризованную среду в чашках Петри. С целью дифференциации истинных вариантов от моднфикащш производили 4-5-кратное пассирование. Анализ естественной изменчивости исходного штамма показал, что штамм представлен 2-мя типами колоний. Внешний вид колоний представлен на фотографии.

1-й тип колоний характеризуется морфологическими свойствами типичными для исходной культуры Staphylococcus saprophyticu L,-1j диаметр которых составляет 0,8- 2,0 мм. После 48 ч инкубаади штамм в центре колонии образует выпуклость зелено ватого оттенка. Активность вариантов образующих 1-й тип колоний, выращенных глубинным способом составляет 3,4±0,6 ег/мг ацетонового препарата клеток и 8,8 ед/мл куль туральной жидкости. Колонии 2-го типа характеризуются меньашм диаметром, достигающим 0,5-1,2 мм, более интенсивным блеском, образующийся выступ зеленоватого оттенка в центре колоний носит более расплывчатый характер. с усвояемостью углеводов, присущей ис ходной культуре Staphylococcus saprophy- ticus L-1 приобретена способность усваивать лактозу. Оптимальный уровень биосинте за уреазы в клетках происходит при рН среды 6,0-6,5, в то время как оптимальные значения данной величины, способствующие максимальному уровню накопления данного фермента а клетках исходного штамма 6,8-7,2. Активность вариантов образующих 2-й тип колоний, колебалась в широких ; ределах от 6,2 до 14 ед/мг ацетонового препарата клеток. Принимая во внимание на возможность стабильного .образования уреазы на высоком уровне, производили дальнейшую селекцию колоний 2-го типа. В результате проведенной работы был отобран вариант 10, стабильно сохраняющий высокий уровень биосинтеза уреазы при многократных пассироканиях, с активностью сос тавляющей 13,6 ед/мг ацетонового препарата клеток. Штамм Staphylococcus saprophyticus L-1.1 хранится в коллекции музея культур микро организмов института ВНИИгенетика под номером ЦМПМ В-2346. Штамм имеет следующие характеристики. Морфологические. Шаровидные бактерии. В основном одиночные, нередко образуют гроздья, неподвижны, спор не образуютВеличина клеток односуточной культуры на МПА-0,5-1,5 мк в диаметре. Клетки хорошо окрашиваются разбавленным основным фуксином и метиловым синим, грамположительные. Культурально-физиологические свойства. Н МПА после 24-х часов инкубации при 37° С образуют колонии диаметром 0,5-1,2 мм. лонии серовато-белые непрозрачные, гладкие блестящие, с правильными или иногда с лег ка неправильными краями. После 48-72 ч в центре колоний образуют расплывчатую вы пуклость зеленоватого оттенка. В МПД внач ле образуют мутность, которая позднее осед ет на дно пробирки. Среда становится и ос 4 ается прозрачной. На поверхности картофеля е растет. Штамм является факультативным аназроом с оптимальной температурой роста ±37С. рахмал не гидролизируют. Молоко не пептоизирует. Желатину не разжижает. На среде с инеральным источником азота не растет. итраты восстанавливает в нитриты. Усваиват мальтозу, глюкозу, фруктозу, глицерин, ахарозу, лактозу. Не усваивает арабинозу , силозу, сорбит, рамнозу, маннит, дульцит инозит. Устойчив к лизоциму. Содержание +П в ДНК колеблется в пределах 30,55,0 моль.%. Культура хранится в пробирках а агаризованной среде под вазелиновым масом и в лиофилизированной состоянии. Пример. Для хранения и выращиваия штамма Staphylococcus sapraphyticus Ь -1.10 используется среда следующего сотава:Натрий хлористый, г5,0 Натрий азотнокислый, г2,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный, г2,0 Ферментативный гидролизат дрожжей, г20,0 Кукурузный экстракт, мл20,0 Вода, мл980 Ферментативный гвдролизат дрожжей и кукурузный экстракт суспензируют в 1,5 объеме воды от конечного объема среды. 30%-ным растворов едкого натра доводят до рН 6,0-6,5 и стерилизуют при в течение 20 мин. После охлаждения раствора до комнатной температуры, с целью удаления нерастворимых частиц центрифугировали при 4000 об/мин 40 мин. Надосадочную жидкость водой доводят до конечного объема среды и вносят оставшиеся компоненты. Вторичную 1 стерилизацию полученного раствора производят при 135° С 40 мин. Для оживления штамм Staphylococcus sap- rophyticus L -1.10 засевают на агаризованную среду с чашках Петри и инкубируют при 37° С в течение 20-24 ч. В лабораторных опытах оживленную культуру засевают в 750 мл колбы, содержащие 100 мл питательной среды и выращивают на качалке при 180 об/мин при 37°С в течение 20-24 ч. При культивировании в ферментерах посевным материалом служат клетки, предварительно выращенные в колбах на качалке -в течение 10-12 ч. Выращивание производят при аэрации 8 , 37° С в течение 20-24 ч, рН в процессе культивирования не поддерживают. Контрольным ипаммом во всех опытах

служит штамм Staphylococcus saprophyticus I -1.

В процессе выращивания определяют уреазиую активность в высушенных охлажденным ацетоном клетках. Из веса ацетонового препарата клеток рассчитывают уровень уреазной активности в мл кулыуральной жидкости. Активность уреазы определяют колориметрическим методом с использованием реагента Несслера. За единицу активности принимают

В ксжце каждой ферментации из кулыуральной жидкости бактериальные клетки вьзделяют центрифугированием при 14000 об/мин в течение 30-40 мин. Собранные и взвешенные клетки разрушают механически, используя стеклянные шарики диаметром 0,1 - 0,4 мм. Полученный гомогенат клеток центрифугируют при 14000. об/мин 40 мин, и в

Как видно штамм Staphylocpccus saprophy- ticus Ц- 1.10 в культуральной жидкости накапливает в Два раза больше уреазы. чем исходаый штамм Staphylococcus saprophyticus

LI -1. Специфическая активность в клеточном экстракте нового штамма приблизитель- но в 4 раза превышает специфическую активность в клеточном экстракте исходного штамма.

такое количество фермента поД действием которого выделяется 1 мкмоль аммиака за 1 мин при ЗОС.

J Было установлено, что максимальное накопление уреаш в клетках, данного штамма. выращиваемых как в колбах так и в ферментере происходит от 12 до 18 ч. Результаты испытаний предлагаемого штамма пред10 i ставлены в табл. 1.

IТаблица

надосадочный жидкости измеряют уреазную активность и концентрацию белка. Белок определяют методом Лоури. Используя в качестве органического осадителя этиловый спирт из клеточного зкстракта выделяют ферментный препарат уреазы.

Полученные данные представлены в табл. 2.

Табли-ца 2

Использование штамма Staphylococcus Pirophyticus L-1.10 позволяет в 3,2 раза повысить уреазную активность сухого ферментного препарата и в 5 раз .специфическую активность выделенной уреазы, по сравнению с использованием исходного ийамма Staphylo- coccus saprophyticus , -1. Выделение уреазы и культивирование штамма в ферментерах не меняет материальных и трудовых затрат на производство данного фермента по сравнению с использованием исходного штамма Staphylo(ccus saprophyticus . поэтому применение нового штамма позволяет снизить удельную (. уреазной активности себестоимость производимой уреазы. Себестоимость уреазы выделенной из клеток Staphylococcus saprophyticus L-1.10 составляет 0,05 руб/1000 ед. по сравнению с 0,10 руб/ 1000 ед ферментного препарата, выделенного из исходного штамма. По имеющимся запросам ориентировочная годовая потребность в XI пятилетке - 600000000 ед. Ожидаемая годовая экономия от производства уреазы 38 во ВНИИПЭ из клеток Staphylococcus saprophyticus U -1.10 составляет 30000 руб. Формула изобретения . Штамм Staphylococcus saprophyticus I-1.10 (коллекция Музея культур микроорганизмов института ВНИИгеиетика, коллекционный номер ЦМПМ В-2346) - продуцент уреазы. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Van WyK and Steyn. P. Journal of benerat Microbiology, 91,2, 225-232, 1975. 2.Авторское свидетельство СССР №П575986, кл. С 12 N 15/00, 1979 (прототип).