Штамм бактерий Bacillus licheniformis BHa 36-R, обладающий уреазной и кальцинирующей активностью и предназначенный для улучшения функциональных свойств строительных материалов на основе цемента или бетона и продукции экзополисахаридов Российский патент 2025 года по МПК C04B28/00 A61K35/74 

Изобретение относится к области биотехнологии и может использоваться для создания бетонных строительных материалов повышенной прочности и долговечности, а также для промышленного получения новых экзополисахаридов и уреаз.

Бетон - важнейший конструкционный строительный материал, различные виды которого используют для создания разнообразных изделий, зданий и сооружений. Значительное число современных исследований в области строительного материаловедения направлено на повышение прочности и срока службы бетонных конструкций, а также на разработку и внедрение ресурсосберегающих технологий производства бетона, что должно оказать положительное влияние на окружающую среду и на экономику строительной отрасли.

Инновационным направлением в области улучшения качества строительных материалов является разработка природоподобных технологий, основанных на использовании живых микроорганизмов, способных индуцировать внеклеточное осаждение карбонатов кальция.

Среди таких организмов наиболее эффективной считается группа уробактерий, которые гидролизуют мочевину - основной продукт деградации азотсодержащих органических соединений животного происхождения - с образованием ионов аммония и карбонатов/бикарбонатов, что вызывает повышение рН окружающей среды и в богатых кальцием средах, таких, как цементные растворы, приводит к образованию кристаллов карбонатов кальция, сначала на поверхности клеток, а затем и в значительно больших масштабах.

Известна добавка в цементнобетонные смеси (а.с. №554237, С04В 13/24, опубл. 15.04.1977). В качестве добавки предложена биомасса микроорганизмов следующего состава, вес.%: белок 60, нуклеиновые кислоты 8, углеводы 12, липиды 7, зола 7, влага 6. Биомасса, взятая в количестве 0,25 в.ч. в составе бетонной смеси цемента, оказывает пластифицирующее действие на бетонные смеси, позволяет повысить прочность образцов на 14,3% и снизить расход цемента.

Также известна бетонная смесь (патент РФ №2133238, С04В 28/02, опубл. 20.07.1999), включающая цемент, заполнитель, белок-содержащую добавку и воду. В качестве белок-содержащей добавки используют продукт жизнедеятельности микроорганизмов, обработанный серной кислотой в соотношении 10:3, при следующем соотношении компонентов, мас.%: цемент 20,581-20,583, заполнитель 70,883-70,890, продукт жизнедеятельности микроорганизмов, обработанный серной кислотой в соотношении 10:3 (по сухому веществу) 0,002-0,01, вода остальное. Предлагаемая бетонная смесь позволяет улучшить прочностные характеристики готового бетона: прочность при сжатии - на 14,4%, прочность при изгибе - на 17,5%.

Наряду с применением белок-содержащих добавок и обработанной биомассы микроорганизмов известны способы повышения прочностных характеристик бетона за счет добавления в бетонные смеси живых микроорганизмов.

Известен способ получения добавки для бетонной смеси (патент РФ №2133239, С04В 28/02, опубл. 20.07.1999) путем культивирования на питательной среде микроорганизмов - бактерий вида Leuconostos mesenteroides. Культивирование осуществляют на синтетической питательной среде с добавлением кислоты в течение 24-48 ч при температуре 23-25°С в качалочном режиме. Недостатком данного способа является невысокий эффект в повышении прочности готового бетона (прочность при сжатии увеличивается на 3,1%). Кроме того, при превышении дозы микробной добавки прочность бетона снижается.

Известна биодобавка для бетонной смеси (патент РФ №2488564, С04В 28/00, опубл. 27.07.2013), содержащая микроорганизм вида Leuconostoc mesenteroides, культивируемый на синтетической питательной среде, и дополнительно, микрокремнезём при следующем соотношении компонентов, мас.%: микроорганизм вида Leuconostoc mesenteroides, культивируемый на синтетической питательной среде - 33-44, микрокремнезем - 56-67. Однако для данного изобретения отсутствуют достоверные доказательства повышения прочностных характеристик бетона от применения биодобавки.

Одним из перспективных путей улучшения функциональных свойств строительных материалов является использование процессов микробно-индуцированного осаждения карбонатов кальция (МИОК). Такой процесс индуцированной биоминерализации в последние годы рассматривается как перспективный метод для защиты и укрепления разрушающихся строительных материалов. Особый интерес научного сообщества связан с разработкой новых самовосстанавливающихся материалов на основе кальцинирующих бактерий, которые способны «залечивать» дефекты структуры бетона путём заполнения их биогенными кальцитами и тем самым, восстанавливать физико-механические свойства бетона.

Наиболее близкой по достигаемому результату (прототипом) является добавка для строительных смесей (патент РФ №2515932, С04В 28/00, опубл. 20.05.2014), содержащая следующие компоненты, мас.%: микроорганизмы вида Leuconostoc mesenteroides, культивируемые на синтетической питательной среде - 0,5-2,7; микрокварц - 97,3-99,5. Предлагаемая добавка позволяет повысить прочность бетона при изгибе на 22,9%. Недостатком этого способа является низкий эффект в повышении прочности бетона при изгибе и отсутствие эффекта в повышении прочности при сжатии.

Ещё одной из проблем эксплуатации бетона является его склонность к растрескиванию - явление, которое препятствует целостности и прочности строительных материалов. Эта проблема особенно актуальна в странах и регионах с сухим и жарким климатом и с резким перепадом температур, где строительные смеси слишком быстро теряют влагу при отвердении, что вызывает слишком большую пластическую усадку, нарушение химической структуры образующегося бетона и как следствие, снижение прочности и долговечности материала. Принято считать, что долговечность бетона зависит от характеристик его поровой структуры. Механизмы разрушения бетона часто зависят от способа проникновения потенциально агрессивного вещества в бетон. Проницаемость бетона зависит от пористости и связей между порами. Чем более открыта структура пор бетона, тем более уязвим материал, так как деградация бетона вызывается проникающими веществами. Поэтому качество бетона зависит не только от прочностных параметров (прочность при изгибе и сжатии), но и от пористости и водопроницаемости, а также от влагосодержания исходной строительной смеси.

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового микроорганизма - биологического агента для улучшения функциональных свойств строительных материалов. Техническим результатом, на достижение которого направлено изобретение, является повышение прочности строительных материалов, а также повышение влагосодержания цементного раствора для изготовления строительных материалов.

Указанный технический результат достигается использованием нового штамма бактерий Bacillus licheniformis, депонированного в Коллекции промышленно важных микроорганизмов Института микробиологии АН РУз, Узбекистан, под регистрационным номером 387 и в Коллекции уникальных и экстремофильных микроорганизмов различных физиологических групп биотехнологического назначения UNIQEM под регистрационным номером UQM 41805, для улучшения функциональных свойств строительных материалов из цемента и бетона и повышения эксплуатационной надежности конструкций на их основе.

Предлагаемый штамм бактерий Bacillus licheniformis BHa 36-R характеризуется следующими свойствами:

- спорообразующие бактерии;

- способны гидролизовать мочевину и продуцировать внеклеточную уреазу (уреолитические свойства);

- обладают кальцинирующей активностью (индуцируют внеклеточное осаждение карбоната кальция при гидролизе мочевины в богатой кальцием среде);

- устойчивы к высоким значениям рН среды (до рН 11);

- устойчивы к температуре (до 60 °С).

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что клетки бактерий в составе цементирующего раствора активируются при попадании в структуру бетонной/цементной матрицы атмосферного кислорода и влаги. После активации в области вокруг бактериальной клетки в результате ее жизнедеятельности возникают условия для осаждения кальция, а именно повышение рН среды и продукция карбонатов/бикарбонатов, что приводит к повышению прочности строительного материала - бетона или цементного камня.

Штамм бактерий Bacillus licheniformis BHa 36-R выделен из семян саксаула чёрного (Haloxylon aphyllum (Minkw)), произрастающего на территории бывшего Муйнакского залива Аральского моря, Каракалпакстан, Узбекистан, методом накопительных культур и последовательных пересевов.

Штамм обильно растёт на богатых белковых агаризованных и жидких питательных средах (МПА, МПБ, средах Дика и Кристенсена). Основные используемые субстраты - полипептиды (пептон, дрожжевой экстракт, говяжий экстракт). Штамм является факультативным анаэробом, каталаза-положительным, нейтрофилом, мезофилом (способен развиваться при температурах от 20°С до 60°С, при этом оптимальной температурой роста является 37-40°С), галотолерантным (растёт при концентрации до 10% NaCl в жидкой среде). Рост на агаризованной питательной среде МПА сопровождается образованием двух типов колоний - отдельных округлых ослизнённых и крупных плоских, шероховатых, с неровным волнистым краем; цвет колоний светлый белый; консистенция колоний сухая или слизеподобная, плотная, легко снимается бактериологической петлёй. При росте на жидких или агаризованных средах штамм продуцирует водорастворимые экзополисахариды. В жидкой среде продукция экзополисахаридов вызывает образование крупных агрегатов клеток. Морфологические особенности штамма: вегетативные клетки - палочки неправильной формы, вибрионоподобные или грушевидные, размерами 0,6-0,8 мкм в ширину и 1,5-3,0 мкм в длину, окрашиваются по Граму положительно, подвижны, капсула и другие поверхностные структуры отсутствуют. Клетки образуют споры, при культивировании на жидких средах в поздней экспоненциальной и стационарной фазах роста образуют скопления - розетки.

Штамм способен использовать мочевину в качестве основного углеродного субстрата, при этом, он гидролизует её до аммиака и СО₂ (ионов карбоната/бикарбоната) путём продукции внеклеточной уреазы. Гидролиз мочевины сопровождается повышением рН среды и в средах, богатых ионами кальция, вызывает процесс биокальцинирования - образование кристаллов кальцитов на поверхности отдельных клеток, колоний и в толще жидкости.

Способ определения активности штамма. Уреазную активность штамма определяют на агаризованной среде Кристенсена с добавлением индикатора (NaCl - 5,0 г/л; мочевина - 20,0 г/л; KH₂PO₄ - 0,6 г/л; K₂HPO₄ - 0,6 г/л; глюкоза - 1,0 г/л; пептон - 2,0 г/л; агар-агар - 1,5-2,0, мас. %; рН 6,6-6,8 ед.). Для получения индикаторной среды на 1 л добавляют 6,0 мл водного раствора фенолового красного (феноловый красный 0,2 мас. %). Мочевину и индикатор добавляют стерилизующей фильтрацией. Степень уреазной активности определяется интенсивностью окрашивания индикаторной среды: чем интенсивнее розово-красный цвет среды, тем интенсивнее уреазная активность штамма. Кальцинирующую активность определяют на той же среде по визуальному наблюдению образования кристаллов кальцита на поверхности клеток с подтверждением их образования световой микроскопией колоний, а также электронной микроскопией с микрорентгеновским анализом.

Способ и условия длительного хранения штамма: в аэробно высушенном или лиофилизированном состоянии в сухом, тёмном месте при комнатной температуре.

Способ хранения культур штамма в активном состоянии: на агаризованных средах LB или Дика (пептон - 3,0 г/л; KH₂PO₄ - 0,6 г/л; K₂HPO₄ - 0,6 г/л; NaHCO₃ - 2,12 г/л; мочевина - 10,0 г/л; глюкоза - 2,0 г/л; рН 7,0-7,5 ед.; стерилизация при 121°С в течение 15-20 мин; мочевину добавляют стерилизующей фильтрацией) в чашках Петри или в микробиологических пробирках на скошенном агаре в холодильнике при температуре 4-6°С.

Способ и условия для размножения штамма: поверхностное культивирование на агаризованных средах МПА, Дика или Кристенсена в чашках Петри или в микробиологических пробирках на скошенном агаре при температуре 37°С. Глубинное периодическое культивирование на питательных средах МПБ, Дика или Кристенсена в конических колбах Эрленмейера объёмом 250 мл, с заполнением питательной средой до 50-100 мл, при температуре 35-37°С, при постоянном перемешивании/встряхивании 150-180 об/мин, в течение 2-4 суток.

Генетические особенности штамма не выявлены. Генетические манипуляции со штаммом не производились. Систематическое положение штамма подтверждено методом молекулярной филогении с помощью секвенирования и анализа полной последовательности гена 16S рРНК.

Сведения о безопасности использования штамма:

а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других

организмов, генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик;

б) штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Эффективность предлагаемого штамма для улучшения свойств цементных изделий подтверждается экспериментальными исследованиями при введении сырой биомассы в качестве добавки в строительную смесь и описывается следующими примерами.

Пример 1

Для введения в состав цементных растворов использовали свежую сырую биомассу штамма бактерии Bacillus licheniformis BHa 36-R. Культуру получали в процессе глубинного культивирования штамма на питательной среде следующего состава: пептон - 3,0 г/л; KH2PO4 - 0,6 г/л; K2HPO4 - 0,6 г/л; NaHCO3 - 2,12 г/л; мочевина - 10,0 г/л; глюкоза - 2,0 г/л; рН 7,0-7,5 ед. Перед культивированием питательную среду стерилизовали при 121°С в течение 15-20 мин. Мочевину добавляли с простерилизованную среду методом стерилизующей фильтрации. Глубинное культивирование проводили в конических колбах объемом 250 мл, с заполнением питательной средой до 100-150 мл, при температуре 30°С±2°С, при постоянном перемешивании на качалке при 120-130 об/мин, в течение 3-4 суток. При культивировании визуально контролировали образование экзополисахаридов (ЭПС) культурой, инкубацию останавливали при появлении мелких сгустков биомассы в культуре, не допуская образования крупных хлопьевидных скоплений биомассы, свидетельствующих об активной продукции ЭПС. Концентрация биомассы, полученной таким образом, с минимальным количеством ЭПС, составляла 1 мас.% по сырому весу.

Для испытания образцов цементного камня с добавлением биомассы штамма BHa 36-R были изготовлены цементные образцы в виде кубиков стороной 2 см. Для формования цементных образцов использовали портландцемент Ц I 500+ производства "Бекабадцемент" при водоцементном соотношении В/Ц=0,35. Для приготовления цементного теста в навеске цемента с препаратом делали углубление и вливали в него отмеренное количество среды Дика, перемешивали массу в течение 2 минут, стараясь втирать среду в цементный порошок до получения цементного теста. Для испытания использовали 2 типа контролей - из цементного теста, приготовленного на дистиллированной воде и на культуральной жидкости, оставшейся после отделения биомассы центрифугированием. Для приготовления опытного образца цементного камня в цементный порошок добавляли культуральную жидкость в В/Ц=0,35, а затем сырую биомассу в количестве 1% от массы сухого цемента. В этом случае для приготовления цементного теста одновременно замешивали сухой порошок цемента, культуральную жидкость и биомассу.

Заполняли половину объёма формы цементным тестом и уплотняли массу, после чего заполняли форму оставшимся цементным тестом до краёв и уплотняли полученное цементное тесто на вибростенде по стандартной методике для тестирования цементных строительных материалов. Дальнейшее твердение образцов происходило в воздушно-влажных нормальных условиях в эксикаторе при комнатной температуре. В процессе твердения отбирали образцы цементного камня для испытания на прочность при одноосном сжатии на 7е и 28е сутки. Результат испытания образцов полученного цементного камня после 28 суток твердения представлен в таблице 1.

Таблица 1

Испытуемый образец Показатели испытаний Масса, г Объём, см³ Плотность, г/см³ Прочность при сжатии, МПа Удельная прочность, кН*м/кг контроль 19,0 9,30 2,04 60,4 29,6 контроль 19,3 9,26 2,08 27,1 13,0 опытный 12,9 8,37 1,54 37,2 24,1 опытный 17,2 8,65 1,99 53,4 26,8

Указаны данные по контрольным образцам на основе культуральной жидкости без биомассы, как описано в Примере 1.

По результатам испытаний происходило увеличение удельной прочности цементного камня, содержащего биомассу штамма BHa 36-R, в среднем, на 10% по сравнению с контролем, приготовленным на основе культуральной жидкости без биомассы. Кроме того, опытные образцы цементного камня после 28 суток твердения имели меньшую плотность.

Таблица 2

Нормальное хранение Стрессовые условия Разность удельной прочности, кН*м/кг масса, г плотность, кг/м³  Предел прочности, МПа Удельная прочность, кН*м/кг масса, г плотность, кг/м³  Предел прочности, МПа Удельная прочность, кН*м/кг КЖ1-1 19,0 2043 35 17,1 18,8 2022 23 11,4 -5,7 КЖ1-2 19,3 2084 25 12,0 19,6 2117 20 9,4 -2,6 Среднее 30 14,6 21,5 10,4 -4,2 Б2-1 12,9 1541 26 16,9 17,3 2067 16 7,7 -9,2 Б2-2 17,2 1988 30 15,1 16,3 1884 19,5 10,4 -4,7 Среднее 28 16,0 17,8 9,1 -7,0

В результате проведенных испытаний установлено, что при добавлении бактерий Bacillus licheniformis BHa 36-R в цементную смесь в количестве около 1,0 мас.% увеличивается удельная прочность образцов цементного камня при одноосном сжатии, в среднем, на 30%. В стрессовых условиях, связанных с длительным нагреванием и резким увлажнением, имитирующих резкие изменения погодных условий в регионах с аридным, резко континентальным климатом, происходит падение удельной прочности образцов на сжатие, но при этом плотность образцов цементного камня с бактериальным штаммом увеличивается после стрессового увлажнения по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует о лучшем удержании влаги образцами биоцемента, и возможности повышения износостойкости изделий из него, в частности дорожных покрытий.

Эффективность предлагаемого штамма в качестве продуцента ЭПС подтверждается экспериментальными исследованиями при культивировании на твёрдой питательной среде.

Пример 2

Для максимального выхода ЭПС штамм BHa 36-R высевали газоном на агаризованную среду LB и культивировали в течение 5 суток при субоптимальной температуре роста (25-30°С). Используемая среда LB содержала в 1 л: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 1 масс.% агар-агара; среду автоклавировали при 121°C в течение 20 минут, pH среды после охлаждения составлял 7,5 ед., уровень рН подводили добавлением 10 масс.% раствора NaOH перед стерилизацией. При культивировании субоптимальных условиях культура штамма BHa 36-R образовывала ослизнённые колонии, с которых физиологическим раствором смывали биомассу с ЭПС. Из полученной суспензии водорастворимые ЭПС доступны для экстракции рутинными методами. Относительное содержание ЭПС в культуре или суспензии контролировали окраской специфичным красителем конго красным.

Эффективность предлагаемого штамма в качестве продуцента внеклеточной уреазы подтверждается экспериментальными исследованиями при культивировании на жидких средах Дика или Кристенсена.

Пример 3

Для максимальной продукции внеклеточной уреазы штамм BHa 36-R культивировали на жидких средах Дика или Кристенсена вышеуказанного состава, но без добавления кальция. Культивирование вели при оптимальной температуре 35°С в конических колбах, как в Примере 1, в течение 5 суток, до достижения стационарной фазы роста культуры, что контролировали световой микроскопией и подсчётом клеток, а также по появлению окраски среды в качественной реакции с красителем феноловым красным. Из полученных культур отделяли биомассу, как указано в Примере 1. Далее, из полученной культуральной жидкости, содержащей уреазу, этот фермент может быть очищен рутинными методами энзимологии, например, согласно патенту SU823411951A, SU1070162A1, опубл. 30.01.1984.

Область применения штамма Bacillus licheniformis BHa 36-R: биотехнология, в частности улучшение функциональных свойств строительных материалов (биоминерализация, упрочнение бетонных сооружений, повышение влагосодержания бетона в условиях засушливого климата), продукция экзополисахаридов, продукция уреазы для применения в пищевой, медицинской промышленности или в технологиях биоремедиации.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой Штамм бактерий Bacillus licheniformis BHa 36-R, обладающий уреазной и кальцинирующей активностью. Изобретение позволяет улучшить функциональные свойства строительных материалов на основе цемента или бетона и продукции экзополисахаридов. 2 табл., 3 пр.

Штамм бактерий Bacillus licheniformis BHa 36-R, депонированный в Коллекции уникальных и экстремофильных микроорганизмов различных физиологических групп биотехнологического назначения (UNIQEM) под регистрационным номером UQM 41805, обладающий уреазной и кальцинирующей активностью и предназначенный для улучшения функциональных свойств строительных материалов на основе цемента или бетона и продукции экзополисахаридов.