Штамм @ @ @ продуцент уреазы Советский патент 1986 года по МПК C12N9/78 C12N1/20 C12N9/78 C12R1/44 

Изобретение относится к микробиологической промьЕпленности, а именно к получению нового штамма, -используемого дая получения фермента уре азы,

Целью изобретения является получение нового штам1-1а - продуцента уреазы - с более высокой и стабильной активностью в условиях глубинного культивирования,

Штамм Staphylococcus saprophyticus L-1.10,v, получен путем целевого селекционного отбора наиболее активных вариантов Staphylococcus sapro,phyticus L-1.10. Установлено, что в пределах морфологически нераз ччкыыХ. колоний вариантов наблюдается определенный размах спонтанной изменчивости по признакам биосинтетической активности. Принимая во внимание возможность стабильного образования уреазы на верхних пределах в результате спонтанной биосинтетической способности образования этого фермента, проводили целенаправленное более детальное изучение естественной изменчивости Staphyloaoccus saprophyticu.s L-lelO,

С целью отбора возможных более активных вариантов производили рассев исходной бактериальной суспенаии Staphylococcus-saprophyticus L-1.10 на агаризованную среду в чашках Петри. Культура оставалась стабильной по способности образовывать характерные ей колонии дигшетром 0,5-1,2 мм. Количественную оценку накопления уреазы исследовали в клетках, выращенных глубинным способом при в течение 14-16 ч. Активность вариантов колебалась от 16 до 22 ед/мг сухих клеток. В результате дальнейшей селекционной работы был отобран вариант Staphyloсос CUS S aprophyt i cus L-1.10. Y ,,, с т aбильно сохраняющий высокий уровень биосинтеза уреазы при многократных пересевах, с активностью ед/мг сухих клеток. Оптимальный биосинтез уреазы 3 клетках продуцента происходил при рИ среда 5 5 0-5,2 j, в то врем как оптималькое значение данной величины в клетках исходного шта.чма равно 6,0-6,5, Более высокий рН благоприятствует поддержанию стериль™ нести во время культивирования. I Штамм Staphylococcus sapropihyticus L-l,10,v.- продуцент уреазы храНИТСЯ в центральном музее культур MHKpoopraHH3i-iOB института ВНИИгенетика под коллекционным номером ЦМГГМ В-3261.

Морфологические признаки,

В аровидные бактерии. Во время логарифмической фазы роста клетки чаще всего образуют пары и тетрады, а позднее, как правило, располагаются поодиночке и нередко создают скопления в виде гроздьев, неподвижны, спор не образуют. Величина клеток односуточной культуры на МПА 0,5,2 мк в диаметре. Клетки хорошо окрашиваются разбавленным основным фуксином и метиповым синим, грамположительны.

Культурально-физиологические признаки ,

37°C.

На МПА после 24 ч роста при o6pa3,TOT колонии диаметром 0,5-1,2 мм. Колонии серовато-белые непрозрачные гладкие блестящие с правильныгда краями После 48-72 ч в центре колоний образуют визуально почти неразличимуто выпуклость зеленоватого оттенка. В МПБ вначал:е образуют мутность, которая позднее осахд.ается на дно пробирки. Среда, становится и остается щюзрачнойо На поверхности картофеля не растет„

Штамм является факультативным аназробом с оптимальной температурой роста . ТСрахмал не грщролизует. Молоко не п€;птокизирует. Желатину не разжижает. На среде с минеральным источником азота не растет. Нитраты восстанавливаат в нитриты. Ассимилирует углеводы: мальтозу, глюкозу, фруктозу, сахарозу, лактозу, а также глицерин. Не усваиззает арабинозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, маннит, дульцит и инозит. Устойчив к лизоциму. Содержание Г+Ц оснований в ДНК . составляет 30,5-35,0 мол.%. Культура хранится в пробирках на агаризов ан-j ной среде под вазелиновым маслом и в лиофилизированном состоянии.

5Q П р и м е. р о Для хранения и выращивания ffiTaiyma Staphyiococcus saprophj-ticus L-1J.O.V, используется среда следующего состава, г/л: натрий хлористый 5-0; натрий азотнокислый

55 2,55 калий фосфорнокислый однозамещенный ферментативный гидролизат дрожжей 10,0; кукурузный экстракт 40,0, 3 Ферментативный гидролизат дрожжей кукурузный экстракт и минеральные соли суспендируют в 1/5 объеме воды от конечного объема среды, 30%-ным раствором едкого натра доводят до рН 5,0 и прогревают при 90°С в течение 30 мин. После охлаждения раст вора до комнатной температуры с целью удаления нерастворимых частиц центрифугируют при 400 об/мин в течение 40 мин. Недостаточную жидкост водой доводят до конечного объема среды. Стерилизацию полученного рас вора проводят при 40 мин. Для получения посевного материала культуру, хранимую в пробирках со скошенным агаром или под слоем стерильного вазелинового масла при 4°С, высевали на чашки Петри и термостатировали в течение 24 ч при 37 С. Выросшую культуру с чашек пересевали в колбы объемом 750 мл, содержащие 100 мл среды, и выращивали на качалке (180 об/мин) при в течение 4-5 ч. Инокулят засевали в количестве 10 бактериальных клеток на 1 мл питательной среды. Культуру в лабораторных условиях выращивали в колбах объемом 750 мл со 100мл среды на качалке (180 об/мин при в течение 16 ч. Культивирование штамма StaphyloGOCCUS saprophyticus L-l,10.v. проводили также в 20- и 250-литровых ферментерах с рабочим объемом 10 или 100 л питательной среды соответственно при 37 С в течение 16 ч. Питательную среду применяли такую же, как и в лабораторных условиях. Посевным материалом служили клетки, предварительно выращенные в колбах на качалке в течение 12-16 ч, Фер- . ментацию в 20-литровых ферментерах производили с подачей воздуха 8 л/ми и перемешиванием среды при 120 об/ми Выращивание в 250-литровых ферментерах проводили при аэрации 8 , В обоих случаях в качестве пеногаси теля использовали силикон (5-6 мл/ /10 л среды). Значения рН 5,1 в про цессе роста не поддерживали. Каждые 2 ч определяли уреазную активность, начиная с 4-го часа культивирования до конца ферментации (14-16-го часа). Изменение уреазной активности в опытах производили в сухих клетках, обработанных охлажденным ацето ном. Из веса сухкк клеток рассчиты724вали уровень уреазной активности на 1 мл культуральной жидкости. Актив- ность уреазы определяли колориметрическим методом с использованием реагента Несслера. За единицу уреазной активности принимали такое количество фермента, в результате действия которого на субстрат выделяется I мкмоль аммиака за 1 мин при 30 С, Результаты испытаний предлагаемого и известного штаммов приведены в табл, 1. Изучение динамики роста и биосинтеза уреазы в клетках нового продуцента, выращенного глубинным способом, показало, что максимальная уре- азная активность наблюдается после 10 ч культивирования и не меняется до 16-го часа роста. Из табл, I видно, что величины максимальной активности уреазы и веса биомассы клеток Staphylococcus saprophyticus L-l,10,v,, выращеншлх как в колбах, так и ферментерах прак тически одинаковы, В .то же-время активность уреазы в 1 №i культуральной жидкости и в 1 мг сухих клеток нового штамма приблизительно на 54% превьш1ает активность фермента в исходной культуре. Кроме того, предлагаемыА штамм Staphylococcus saprophyticus L-l,10,v, максимум уреазы накапливает при росте в кислой зоне при рН 5,0-5,2, что облегчает поддержание стерильности во вреня ферментации, В конце ферментации биомассу от культуральной жидкости отделяли ; нтрифугированием на проточной центрифуге С-44 при 12000 об/мин, Клетки продуцента разрушали механически, используя стеклянные шарики диа 1етром 0,16-0,3 мм. Полученный экстракт клеток центрифугировали при 14000 об/мин, В надосадочной жидкости измеряли уреазную активность и концентрацию белка. Белок определяли методом Лоури, Ферментный препарат уреазы из клеточного экстрак- та получали путем двукратного переосаяздения 3 объемами этилового спирта по отношению к 1 объему экстракта. Полученные данные представлены в табл, 2, Как видно из табл, 2, спо собность / к репродукции клеток как нового, так/ и исходного штаммов одинакова. Одна- .

51270172

ко использование культуры Staphylo- тивность в сухом ферментном препараCOCCUS saprophyticus L-l,10.v. поз- те по сравнению с исходным штамволяет на 25% повысить уреазную ак

ом.

Таблица 1

Штамм Staphylococcus saprophyticus L-l.lO.v. (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетикаУ коллекционный номер ЦМПМ В-3261) продуцент уреазы.

В колбах 0

В колбах1 О

В 10-литро- 4 вых ферментерах.

То же

В 250-литровых ферментерах

St saprophyticus L-i,10.

То же Sto .saprophyticus L-r,10,v,5 96,044,3 Sto saprophyticus 77,013,0 L-i.lO5

1,321,4+1,6 27,8+1,

1,3112,6+1,017,8+1,2

1,3

19,8i2,l25,4+2.6

1,312,9+0,916,8±,3

„32ijl±l,3 27,3+2,2

1,3214,0+0,618,4+1,1

Таблица 2 115,017,0 320,0±8,0 7,7 ,6 23050i3,0 7,7