Способ определения нейротропной активности веществ Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ

ВЕЩЕСТВ

1

Изобретение относится к области выявления свойств веществ, а именно к выявлению нейротропной биологической активности и может быть использовано в медицинской и фармацевтической промышленности для массовых первичных испытаний веществ на биологическую активность.

Известен способ определения нейротропной активности веществ путем идентификации нейронов беспозвоночных 1.

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности.

Известен также способ определения нейротропной активности веществ, заключающийся в том, что белым мышам внутрибрющинно вводят испытуемые вещества в логарифмически возрастающих дозах (10, 20, 40, 80, 160 мг/кг и т. д.) и наблюдают за поведением животных 2 .

Недостатком этого способа являются больщие экономические затраты на выявление одного вещества, обладающего нейротропной активностью, вследствие больщого расхода животных на испытание каждого вещества для получения достоверных результатов, невозможность полной автоматизации эксперимента, что приводит к низкой производительности способа, а также субъективность получаемых визуальным путем данных и косвенность оценки нейротропной активности вещества вследствие того, что регистрируются лишь изменения поведения животных без регистрации электрической активности мозга.

Цель изобретения - повышение точности способа и ускорение проведения исследо10ваний.

Цель достигается тем, что способу определения нейротропной активности веществ путем воздействия ими на биологический объект, в качестве биологического объекта 15 используют виноградную улитку, при этом вещество растворяют в растворе Рингера и вводят-« мозг улитки, анейротропную активность определяют по регистрации электрических параметров нейронов.

Способ осуществляют следующим об20разом.

Центральную нервную систему улитки выделяют и помещают в ванночку с постоянным протоком раствора Рингера для холоднокровных животных. Соединительнотканную оболочку ганглиев удаляют, ванночку помещают в экранированную к меру и под визуальным контролем в идентифицированные нейроны вводятся стеклянные микропипетки, укрепленные на микроманипуляторе типа MM-I, соединенные через подводящий агаровый мостик и неполяризующиеся хлор-серебряные электроды с регистрирующим устройством, связанным с электронно-вычислительной машиной, обрабатывающей данные непосредственно в эксперименте. При этом регистрируются частота потенциалов действия, потенциал покоя, возбудимость на внутриклеточное раздражение, вызванный ответ на ортодромную стимуляцию, действие на искусственную патологию нервной клетки. Возможна также регистрация сопротивления мембраны, реакции на аппликацию определенных медиаторов, пейсмеккерной активности при необходимости углубленного изучения действия вещества. Все параметры регистрируют до воздействия веществом, во время перфузии раствором испытуемого вещества и при отмывании через регулярные интервалы времени; они отражают динамику возникновения эффекта вещества и его исчезновения при отмывании. В случае стабильного эффекта берется средняя величина. Концентрация веществ варьируется ступенчато от 10 М до 10 М. Концентрации веществ больше 10- М не исследуют, так как эффект достигается не специфическим физиологическим действием исследуемого вещества, а его концентрационным действием.

Все параметры регистрируют одновременно на четырех типах нейронов, описанных выще, так как при перфузии вещество действует на все нейроны одновременно.

Оценку действия вещества производят либо по изменению параметров при действии вещества, либо но сопоставлению регистрируемых параметров с действием на те же параметры применяющихся в клинике лекарственных средств, механизм действия которых у-же известен.

Время эксперимента по испытанию одного вещества составляет 2-4 ч в зависимости от особенностей исследуемого вещества.

Вследствие хорошей воспроизводимости результатов, полученных на одних и тех же нейронах, для оценки нейротропной активности одного вещества достаточно двух опытов, т. е. восемь отведений активности нейронов у двух улиток, тогда как достоверные результаты в известно.м способепрототипе могут быть получены только при проведении 5-10 экспериментов, что требует затраты около 20 животных.

Пример. Раковину половозрелой виноградной улитки разбивают, извлекают центральную нервную систему и закрепляют ее в ванночке с восковым дно.м, в которой находится раствор Рингера для холоднокровных имеющий состав, MMrNaCl 80; КС1 4, CaClJ, MgCb 5, Трис 5, рН 7,4. Соединительнотканную оболочку снимают с поверхности подглоточного комплекса ганглиев.

Интестинальный и правый паллиальный нервы накладывают на хлор-серебряные биполярные электроды, соединенные со стимулятором ЭСЛ-2 для нанесения тракссинаптического раздражения.

Стеклянные микропипетки с диаметром кончика менее 0,5 мкм, сопротивлением 10-40 Ом, заполненные ,2 М раствором цитрата калия, которые соединяются через агаровый мостик и неполяризующиеся хлор-серебряные контакты со входом усилителя, вводят в нейроны. При этом автоматически начинается регистрация фоновой активности всех нейронов (частота спонтанных потенциалов действия и потенциал покоя).

Перфузионная система, соединенная с ванночкой, обеспечивает постоянный проток через нее раствора Рингера.

Через 2 мин после начала регистрации на каждый нейрон через мостовую схему подают постоянный деполяризующий ток длительностью 5 с, а спустя 5 мин прикладывают напряжение Iv в течение 0,1 с на хлор-серебряные электроды (при этом регистрируют частоту потенциалов действия на внутриклеточное раздражение и вызванные потенциалы на транссинаптическое раздражение), после чего переключают перфузионную систему на раствор Рингера, содержащий натриевую соль дифенилгидантоина в концентрации 10 М, при непрерывной регистрации электрических параметров - частоты спонтанных потенциалов действия и потенциала покоя.

Через 10 .мин после переключения перфузионной системы на каждый нейрон подают постоянный деполяризующий ток длительностью 5 с, а через 13 мин на хлорсеребряные электроды прикладывают напряжение Iv в течение 0,1 с. При этих операциях регистрируют соответственно частоту потенциалов действия на внутриклеточное раздражение и вызванные потенциалы на транссинаптическое раздражение.

Через 15 мин переключают систему на чистый раствор Рингера, перфузию которым продолжают до возвращения параметров в первоначальное состояние, после чего перфузионную систему переключают на раствор Рингера, содержащий коразол в концентрации 0,5 вес. °/о, и регистрируют судорожные разряды. Через 5 .мин после смены раствора через ячейку пропускают раствор Рингера, содержащий 0,5 вес. % коразола и Ю М натриевой соли дифенилгидантоина.

Затем, продолжая непрерывную регистрацию, поочередно через каждые 15 мин осуществляют аналогичные операции, .меняя лишь концентрацию исследуемого вещества (510 и 10 М). Предложенный способ позволяет повысить производительность в результате полной автоматизации эксперимента, а также точность, сократить экономические затраты более чем в 30 раз и ускорить проведение исследований. Формула изобретения Способ определения нейротропной активности веществ путем воздействия ими на биологический объект, отличающийся тем, что, с целью повыщения точности способа и ускорения проведения исследований, в качестве биологического объекта используют виноградную улитку, при этом вещество растворяют в растворе Рингера и ввог дят в мозг улитки, а нейротропную активность определяют по регистрации электрических параметров нейронов. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Kandel Е. R. basis of Behavior. San. Fr. Freeman, 1976, p. 11 - 16. 2.Раевский К. С. Фармакология нейролептиков. М., «Медицина, 1976, с. 83-99.