Способ определения нейротропной активности биологически активных веществ Советский патент 1986 года по МПК G01N33/15 

I

Изобретение относится к медицине в частности может быть использовано для фармакологических испытаний и скрининга биологически активных веществ ,

Цель изобретения - упрошенке способа, повышение чувствителЁности и дополнительное определение ГАМК-по- тенцирующей ак тивности веществ.

Цель достигается за счет использования в качестве биологического препарата изолированного спинного мозга крыс, суспендированного в солвом растворе Кребса,

Спосо-б осуществляется следующим образом.

У крысят 7-14 дневного возраста под глубоким эфирным наркозом извлекают часть позвоночного столба ду нижними грудными и поясничными сегментами. Позвоночньш столб помещают на 5 мин в чашку Цетри в охлажденный до 10--i2°C раствор Кребса который интенсивно аэрируют кислородом. Затем путем двусторонней ла- минэктомии IHS позвоночного столба извлекают спинной мозг с отходящими от него вентральными и дорсальными корешками, который подвергают геми- секции в сагитальной плоскости и помещают в перфузионный отсек сахарозного мостика (половину спинного мозга - 2-3 сегмента - с дорсальным и вентральными корешками) ,, где его суперфузир тот оксигенированным модифицированным раствором Кребса следующего состав, мМ/л: NaCE 118; КСЕ. 1; KHjPO 1; CaCl 2,5; NaHCOj2 глюкоза 10; рН 7,310,1. Ширина сахарозной щели 500 мкМ, скорость протекания сахарозы 1 мл/мин сопротивление 0,3 М раствора сахарозы 2-5 х X 10 Ом/см.

Далее с помощью хлорсеребряных электродов регистрируют разность потенциалов между дистальным: концом корешка и спинным мозгом, которые электрически разобщены сахарознь М промежутком:. Указанную разность потенциалов усиливают дифференциальным усилителем постоянного тока от векторэлектрокардиоскопа ВЭКС-1 и регистрируют фотографически с экран осцилоскопа или с помощью самопишущего гальванометра (КСП-4). При этом регистрируют: частоту спонтанных разрядов в ве}1тр;итьных и дорсапь- ных корешках; разлн птыо видь) вызвап.25

ньгх ответов на ортодромную стимуляцию; изменения уровня поляризации мотонейронов и терминалей первичных эфферентов и реакции на аппликации 5 определенных медиаторов. Все параметры регистрируют до воздействия ней- ротропных веществ в момент их воз- дейс твия и при отмьшании спинного мозга. Они отражают динамику возник- новения эффекта и его исчезновение при отмьшании. При этом учитывают, что параметры первой, и второй групп отражают синаптическую передачу в спинном мозге, а параметры третьей 5 группы отражают суммарные постсинап- тические потенциалы мотонейров и терминаяей первичных афферентов.

Сахарозный, мостик формируется через 2.0-25 мин от момента помещения спинного мозга в перфузируемый отсек, при этом спонтанная и вызванная электрическая активность корещков приобретает стабильный характер, после чего приступают к исследованиям. Концентрации веществ, которыми воздей- на спинной мозг, колеблются

9 - Т

от 10 до 10 М. Опыты проводят при комнатной температуре (20-24°С). Время испытаний нейротропной активности одного фармакологического средства 4-6 ч в зависимости от особенностей спектра исследуемых веществ а для оценки общего характера ней- ротрогшого действия одного испытуе35 мого вещества достаточно четырех опытов на четырех крысах.

Пример 1. Подготовку срезов спинного мозга 11-дневного крысенка . осуществляют указанным образом. рез 20 мин после помещения спинного мозга в перфузионный отсек регист- рирзпот изменения электротонических потенциалов (ЭТП) дорсального корешка, вызываемые воздействием на спин 5 ной мозг ГАМК (IxlO M) в присутствии хлордиазепоксида гидрохлорида. Для этого регистрируют исходный де- поляризационный ЭТЦ дорсального- ко- рещка при воздействии на спинной

50 мозг ГАМК, после чего мозг отмывают в течение 10 мин раствором Кребса, а затем суперфузируют 15 мин раствором, содержащим хлордиазепок- сид (х10 М)., На 15-й мин контакта

55 среза мозга с хлордиазепоксидом на него вновь воздействуют ГАМК и регистрируют деполяризационный ЭТП в дорсальном,корешке. Затем мозг

30

10 мин отмывают раствором Кребса и повторяют все процедуры с хлорди- азепоксидом в концентра1ши ,

Из табл. видно, что исследуемо нейротропное средство - хлордиазе покбид, усиливает воздействие на

, спинной мозг ГАМК - ответы терми- налей первичных афферёнтов. Нейротропное действие хлордиазепоксида проявляется медиаторпотенцирующим действием (ГАМК-потенцирующим) и может быть охарактеризовано коли- -чественно, например, по величине , т.е. концентрации хлордиазепоксида, в присутствии которой стан дартньй эффект ГАМК возрастает на 50%. Эта концентрация может быть найдена из индивидуальных опытов и составляет 1,2iO,3xiO. По известному способу ГАЖ-потенцирующая активность определена быть не может. Пример 2. Подготовку срезов спинного мозга 10-дневных крысят осуществляют, как и в предыдущем примере. Регистрируют ЭТП вентральных

.корешков, вызьшаеь1ые воздействием на спинной мозг дофамина в концентрации 1-10 и 2-10 М в отсутствие и в пх исутствии галоперидола в кон

1x10

-S

2x10

-5

12 60014

Результаты опытов, получень-ых на четырех срезах спинного мозга, приведены в табл.1.

Таблица I

центрациях i-lO и , т.е. определяют антагонизм нейролептика галоперидола по отношению, к нейроме7 диатору дофамину.

Через 20 мин после помещения рабочего среза спинного мозга в перфу- зионный отсек сахарозного мостика его суперфузируют раствором Кребса, содержащим дофамин в концентрации I lO М. Регистрируют возникающий при зтом гиперполяризационный ЭТП вентрального корешка. Затем срез мозга от ывают 10 мин раствором Кребса, содержащим галоперидол в концентрации ) 0 М. На 10-й мин контакта мозга с галоперидолом на него воздействуют дофамином в удвоенной концентрации и вновь регистрируют гипер поляризационный ЭТП вентрального корешка. Затем мозг отмьшают 30 мин раствором Кребса, после чего 10 мин суперфузируют раствором Кребса, содержащим галоперидол ( М), и т.д. Результаты опытов на четырех крысятах приведены в табл.2.

Таблица 2

0,360,32 0,25- . 0,28

0,430,35 О,ЗА 0,32

Степень антагонизма галопери- дола по отношению к дофамину характеризуют величиной рА2, т.е, отрицательным логари4 1ом молярной концентрации антагониста, в присутствии которой удвоенная концентрация агониста дает такой же эффект, как и одинарная его отсутствия. Найденная в каждом опыте величина рА; равна 6,40, т.е. 4 . Определение антагонизма по известному способу требует использования га- лоперидола в концентрациях, в 100 и более раз высоких, по сравнени с предлагаемым способом.

Редактор Н.Яцола

Составитель А.Агуреев

Техред О.Сопко Корректор С.Черни

Подписное

Заказ 3993/37Тираж 778

ВНИИПИ- Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-32, Раусшкаи иаб., д. 4/5

производственно-полиграфическое п Ч д11рнятие , г . Ужгород, ул . Hpof к i пая , 4

Продолжение табл.2

Формула изобретения

Способ определения нейротропной активности биологически активных веществ путем выделения препарата центральной нервной системы животного, суперфузии его раствором биологически активных веществ в буфере с последующим измерением электрических параметров нейронов, отличающ и и с я тем, что, с целью упрощения иповьппения чувствительностиспособа,

а такжедополнительного определения . ГАМК-потенцирующей активности веществ, в качестве препарата используют изолированный спинной мозг крыс,а в качест- ; ве буфера-солевой раствор Кребса.

Подписное

Изобретение относится к медицине и может, быть использовано для фармакологических испытаний и скрининга биологически активных веществ. Цель изобретения - упрощение способа, повышение чувствительности и дополнительное определение ГАМК-потенцйру- ющей активности веществ. Цель достигается за счет использования изолированного спинного мозга крыс. Готовят срезы спинного мозга. Помещают его в перфузионный отсек на 20 мин. Затем регистрируют изменение электротонических потенциалов (ЭПТ) дорсального корешка, вызываемых воздействием на спинной мозг ГАМК (1 х X ) в присутствии исследуемого вещества. Для этого регистрируют исходный деполяризационный ЭТП .дорсального корешка при воздействии на спинной мозг ГАМК. Затем мозг отмывают в течение 10 мин раствором Кребса и суперфузируют 15 мин раствором исследуемого вещества () . На 15-й мин контакта среза мозга с этим веществом на мозг вновь воздействуют ГАМК и регистрируют ЭТП в дорсальном корещке. Затем мозг 10 мин отмывают раствором Кребса и повторяют все процедуры с исследуемым веществом в концентрации 1х10 М. 2 табл. i СЛ 1C 4 О5