Способ оценки нейротропной и/или нейротоксической активности веществ и их композиций Российский патент 2024 года по МПК G01N33/15 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтике, в частности к клеточной биотехнологии, и может быть использовано в фармацевтической разработке и контроле качества лекарственных средств для оценки их нейротропной активности.

Уровень техники

Точная и воспроизводимая оценка нейротропного и нейротоксического действия веществ и композиций крайне важна как для фармацевтической промышленности при разработке нейромодуляторов, средств, улучшающих регенерацию и трофику нервной ткани, так и для выпускающего контроля серий данной продукции после ее внедрения в производство. Задача установления нейротропной и нейротоксической активности решается различными средствами как in vivo, так и in vitro.

Модели in vivo обычно используются на завершающем этапе доклинических испытаний препаратов для человека с применением дорогостоящего и требующего особого внимания с точки зрения биоэтики объекта - приматов. Так, при разработке способа лечения заболеваний, связанных с нейротрофическим фактором глиальных клеток (GDNF), авторы изобретения JP 6813304 В2 используют средства оценки его эффективности на интактных самках макак-резус и самках со смоделированной болезнью Паркинсона, вызванной применением МРТР (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин), вводя исследуемую антисмысловую олигонуклеотидную композицию в полосатое тело и черную субстанцию с последующим умерщвлением животных через 3 месяца и иммуногистохимической оценкой уровня GDNF. Такой подход может быть оправдан для обоснования клинических исследований препаратов для человека, но не может быть использован в скрининге кандидатных субстанций нейротропного действия или в контроле качества на производстве.

В связи с изложенными обстоятельствами, более распространенными в фармацевтической разработке и контроле качества являются модели in vitro. Известен способ тестирования нейротропного действия веществ, основанный на применении свежевыделенной центральной нервной системы виноградной улитки, помещенной в растворе Рингера, в который вводят испытуемые вещества в концентрациях 5×10^-4-10^-3 М, а эффект оценивается по электрическим параметров нейронов (SU 996910 А1). Этот способ предполагает использование беспозвоночных животных, что снимает значительную часть биоэтических проблем. Вместе с тем, функционирование нервной системы моллюсков и млекопитающих имеет существенные различия, что снижает точность экстраполяции данной модели при использовании в тестировании препаратов для человека.

Существует также способ оценки нейротропного действия веществ, основанный на их воздействии на афферентные окончания одиночного нервного волокна с маркированной серебром зоной рецепторов (SU 1076812 А1). Этот способ позволяет использовать нервную ткань млекопитающих, что облегчает экстраполяцию данных, но трудно стандартизируем, так как на точность могут оказывать сильное воздействие манипуляции, производимые оператором.

Современные методы оценки нейротропной активности основываются на применении клеточных биотехнологий. Так, в качестве аналога заявляемого изобретения может быть рассмотрена система скрининга кандидатных веществ, основанная на применении эмбриональных клеток, позволяющая моделировать болезнь Хантингтона, описанная в изобретении ЕР 3423158 В1. Авторы предлагают использовать популяцию эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК), генетически модифицированную по локусу эндогенного гена Хантингтина (НТТ), в которой около 20% и более клеток дифференцируются in vitro в нейрональные предшественники или в терминально дифференцированные нейроны. Описанный способ позволяет изучать эффективность современных терапевтических, в т.ч. генно-терапевтических, средств при хорее Хантингтона, однако обладает двумя существенными недостатками - узостью возможного применения и необходимостью использовать эмбриональные клетки человека, что нарушает биоэтические нормы.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение решает задачу оптимизации методов скрининга и производственного контроля лекарственных препаратов путем разработки тест-системы, обеспечивающей высокую точность и воспроизводимость оценки нейротропного и/или нейротоксичекого действия.

Технический результат достигается за счет применения выделенных из спинальных ганглиев неонатальных поросят монослойной культуры или мультиклеточных сфероидов, которые содержат нейральные клетки трех морфотипов (полигональные клетки с выраженными уплощенными отростками, веретеновидные клетки с двумя тонкими отростками и крупные распластанные фибробластоподобные), экспрессирующие β-III-тубулин, глутаминсинтетазу, содержащие рецепторы нейронов на поверхности и образующие синапсоподобные структуры.

В культурах, происходящих из спинальных ганглиев, воспроизводятся основные специфические процессы нервной ткани: сенсорное восприятие, аксональный транспорт, передача нервного импульса и регенерация нервов. Описанные свойства позволяют применять культуры, выделенные из спинальных ганглиев для изучения биологической активности и токсичности широкого спектра препаратов, воздействующих на нервную систему.

Применение 3D-культивирования позволяет моделировать процессы регуляторно-трофического взаимодействия с клеточным микроокружением и внеклеточным матриксом, что реализуется в заявленном изобретении в форме мультиклеточных сфероидов.

Многие физиологические процессы в организме свиней протекают схожими с человеческим организмом образом, что позволяет даже разрабатывать системы трансплантации органов от свиньи человеку. Указанное обстоятельство обеспечивает высокую адекватность при экстраполяции полученных данных об активности биологически активных веществ и иных терапевтических средств на организм человека.

Описываемое изобретение представляет собой тест-систему на основе культуры, выделенной из спинальных ганглиев неонатальных поросят, для оценки биологической активности или токсичности веществ, проявляющих действие в отношении нервной системы, с возможностью использования деконсервированных культур, 2D- и 3D-систем культивирования.

Описываемое средство получают и используют следующим образом:

Выделение спинальных ганглиев производят из неонатальных поросят в возрасте 1-3 суток с последующим культивированием 2D- или 3D-способом.

2D-способ представляет собой монослойную культуру на питательной среде альфа-MEM с добавлением 10% сыворотки крови фетальной телячьей, антибиотика и антимикотика. Инкубирование культуры осуществляется при температуре 37°С с 5% СО₂ в атмосфере. Каждые 3-4 суток среду заменяют на новую того же состава.

Полученную 2D-способом монослойную культуру пересевают на 8-10 сутки роста с посевной концентрацией 2,5-5×10⁵ клеток/мл, предварительно сняв с подложки с помощью диспергирующего раствора (0,05% трипсина в растворе Версена). В тестировании используется культура не более чем 5-го пассажа после выделения или 4-го после деконсервирования.

3D-способ представляет собой культуру мультиклеточных сфероидов на питательной среде альфа-MEM с добавлением заменителей сыворотки крови В27, или Нейромакс, или аналогичными, антибиотика и антимикотика. Инкубирование культуры осуществляется при температуре 37°С с 5% СО₂ в атмосфере. Каждые 3-4 суток в течение 8-12 дней половину среды заменяют на новую того же состава, предварительно аспирировав половину отработанной среды. В тестировании используются мультиклеточные сфероиды диаметром 100-200 мкм.

При необходимости культура, полученная из спинальных ганглиев неонатальных поросят, может храниться в сосудах Дьюара в жидком азоте.

Монослойная культура снимается с подложки с помощью диспергирующего раствора, как при пересеве, помещается в криозащитную среду, содержащую 5-10% ДМСО. Охлаждение производится ступенчато в три этапа: в течение часа при температуре минус 20°С, час при температуре минус 80°С или в парах жидкого азота с последующим погружением в жидкий азот.

Мультиклеточные сфероиды освобождаются от питательной среды путем аспирации, оценивается их количество и размер. В криозащитную среду, содержащую 5-10% ДМСО, помещают не менее 50 сфероидов диаметром 100-200 мкм на криоампулу Охлаждение производится ступенчато в четыре этапа: в течение 10-15 минут при температуре 5-8°С, в течение часа при температуре минус 20°С, час при температуре минус 80°С с последующим погружением в жидкий азот.

Образцы, тестируемые с помощью заявленного средства, вносят в лунки с культурой или наносят на микроэлектродные системы, на которые помещена культура, в кратных концентрациях (метод титрования). Применяются положительный (вещество с известной нейротропной активностью, сходное по предполагаемому действию с тестируемым образцом) и отрицательный (вещество с известным нейротоксическим действием) контроли. Оценка действия испытуемых веществ на нервную ткань проводится по показателям пролиферативной активности клеток культуры, визуальным цитотоксическим эффектам - для средств, которые улучшают трофику и стимулируют регенерацию нервной ткани - или по электрофизиологической активности - для средств, влияющих на рецепторные системы, активность каналов мембран и других тонких клеточных структур. Результат оценивают по сравнению с контрольными образцами или путем расчета ED₅₀ и/или LD₅₀ производится методом пробит-анализа или любым другим приемлемым статистическим методом.

Краткое описание иллюстративного материала

Изобретение поясняется таблицами и рисунками.

Таблица 1. Изучение свойств монослойной культуры различных пассажей.

Рисунок 1. Исследование режимов культивирования и хранения монослойной культуры спинальных ганглиев неонатальных поросят.

Таблица 2. Изучение свойств культуры мультиклеточных сфероидов различного диаметра.

Таблица 3. Исследование хранения культуры мультиклеточных сфероидов.

Рисунок 2. Микрофотографии клеток культуры, полученной из клеток спинальных ганглиев неонатальных поросят.

Таблица 4. Применение тест-системы для оценки нейротоксичности.

Рисунок 3. Общий вид мультиклеточных сфероидов.

Возможность осуществления изобретения и эффективность его применения поясняется примерами.

Пример 1. Получение и низкотемпературное хранение монослойных культур, полученных из клеток спинальных ганглиев неонатальных поросят

Спинальные ганглии отбирали у суточных поросят гибридов первого поколения пород крупная белая/ландрас и макстер/дюрок.

2D-культивирование осуществляли на среде альфа-MEM с 10% сыворотки крови фетальной телячьей и добавлением антибиотиков (100 мкг/мл гентамицина и 100 мкг/мл цефотаксима), и антимикотика (2,5 мкг/мл амфотерицина В) при 37°С, 5% СО₂ и относительной влажности свыше 90%. Каждые 3-4 суток производили полную замену питательной среды на свежую того же состава. Пересев культуры осуществляли на 7-10 сутки, в зависимости от степени выполненности монослоя, снимая клетки с подложки с помощью диспергирующего раствора (0,05% трипсина в растворе Версена).

Для установления оптимального пассажа монослойных культур, которые используются в качестве тест-системы, было проведено исследование, в котором в течение 10-ти пассажей изучались такие параметры, как экспрессия маркеров нервной ткани (β-III-тубулин (рис. 2а) и глутаминсинтетаза), фоновый уровень цитотоксичности и пролиферативная активность. Исходя из полученных данных оптимальными являются пассажи не позднее 5-го, что характерно для обоих гибридов свиней (табл. 1).

На следующем этапе проводилось установление оптимальной посевной концентрации. Для этого клетки 1-го пассажа высевались в концентрациях от 1×10⁵ до 1×10⁶ клеток/мл. Было установлено, что наиболее для роста культуры подходят посевные концентрации в диапазоне 2,5-5×10⁵ клеток/мл (рис. 1а).

Монослойные культуры, полученные из спинальных ганглиев неонатальных поросят криоконсервировали. Клетки снимали с подложки с помощью диспергирующего раствора (0,05% трипсина в растворе Версена), помещали в криозащитную среду, содержащую криопротекторы. Охлаждение производили ступенчато в три этапа: в течение часа при температуре минус 20°С, час при температуре минус 80°С с последующим погружением в жидкий азот. Хранение криоконсервированной культуры осуществляют в сосудах Дьюара в жидком азоте.

Для отработки криоконсервирования монослойной культуры было проведено исследование влияния криопротектора на сохранность пролиферативной активности и жизнеспособности культуры. Были изучены варианты, включавшие 10 и 20% глицерина, 10% сахарозы, 2,5-15% ДМСО, контроль - культура, пересеянная на следующий пассаж, не подвергавшаяся заморозке. Наибольшую сохранность изученных параметров культуры обеспечивал ДМСО в концентрации 5-10% (рис. 1б).

Пример 2. Получение и низкотемпературное хранение культур мультиклеточных сфероидов, полученных из клеток спинальных ганглиев неонатальных поросят

Спинальные ганглии отбирали у суточных поросят гибридов первого поколения пород крупная белая / ландрас и макстер/дюрок.

3D-культивирование осуществляли на среде альфа-MEM с добавлением В27 и антибиотиков (100 мкг/мл гентамицина и 100 мкг/мл цефотаксима), и антимикотика (2,5 мкг/мл амфотерицина В) при 37°С, 5% СO₂ и относительной влажности свыше 90%. Каждые 3-4 суток аспирировали половину отработанной питательной среды, которую заменяли на свежую того же состава.

Для установления оптимального размера мультиклеточных сфероидов было проведено исследование, в котором помещали мультиклеточные сфероиды диаметром 100-500 мкм в ростовую среду, содержащую 10% сыворотки крови фетальной телячьей, и оценивали адгезивность (на 1-е сутки после помещения в среду с сывороткой), наличие клеточной миграции (на 2-е сутки) и типы мигрировавших клеток (на 10-е сутки). Снижение адгезивности, способности клеток к миграции или изменение клеточного состава мигрирующей популяции (рис 2б) указывает на отмирание клеток в сфероидах. Было установлено, что сфероиды размером свыше 200 мкм вероятно содержат отмершие клетки, что приводит к значимому ухудшению адгезивных свойств, способности клеток к миграции и элиминации отдельных типов клеток из популяции (табл. 2).

Для криоконсервирования из культуры мультиклеточных сфероидов аспирировали питательную среду, оценивали их количество и размер. В криозащитную среду помещали не менее 50 сфероидов диаметром 100-200 мкм на криоампулу. Охлаждение производили ступенчато в четыре этапа: в течение 10-15 минут при температуре 5-8°С, в течение часа при температуре минус 20°С, час при температуре минус 80°С с последующим погружением в жидкий азот.

Для отработки криоконсервирования мультиклеточных сфероидов было проведено исследование влияния криопротектора на сохранность культуры, которое оценивали по сохранению адгезивных свойств, наличию клеточной миграции и соотношению типов мигрировавших клеток (как указано ранее для установления оптимального размера) после добавления фетальной телячьей сыворотки крови. Так как на монослойной культуре спинальных ганглиев неонатальных поросят было установлено, что оптимальным типом криопротектора является ДМСО, изучались различные концентрации этого вещества. Наибольшую сохранность изученных параметров культуры обеспечивал ДМСО в концентрации 5-10% (табл. 3).

Пример 3. Тестирование нейротропных субстанций на модели спинальных ганглиев неонатальных поросят

Для эксперимента по тестированию был взят препарат «X», не обладающий выраженным нейротоксичным действием. Контроль - нейротоксин в концентрации 0,01 LD₅₀.

Ампулу ранее замороженного в жидком азоте образца мультиклеточных сфероидов размораживали, отмывали от криопротектора путем центрифугирования, и высевали в чашку Петри в среду α-МЕМ с добавлением 2% НейроМакс (НЛП «ПанЭко»), гентамицина (100 мкг/мл) и амфотерицина В (2,5 мкг/мл). Суспензию, содержащую МС размером до 200 нм разделяли на четыре аликвоты - одну контрольную и три экспериментальных. Объем в чашках Петри доводили до 2 мл. В экспериментальные чашки вносили тестируемый препарат «X» в концентрации 10, 20 и 30 мкг/мл. Чашки оставляли при температуре 37°С и 5% СО₂ на сутки. Через сутки с помощью световой микроскопии оценивали морфологические и количественные изменения сфероидов во всех четырех чашках. Далее содержимое чашек центрифугировали 5 минут на 1000 об/мин., надосадочную жидкость удаляли, образцы ресуспендировали в ростовой среде - α-МЕМ с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки крови, гентамицина (100 мкг/мл) и амфотерицина В (2,5 мкг/мл), и переносили в новые чашки Петри. Оценку адгезии мультиклеточных сфероидов производили через 20-24 часа, оценку выселения клеток из сфероидов - через 48 часов. Подсчет выселившихся клеток и распределение их по типам проводили через трое суток после замены среды. К клеткам первого типа относили распластанные полигональные клетки, ко второму - мелкие веретеновидные клетки, к клеткам третьего типа - крупные фибробластоподобные. Для определения процентного соотношения 3-х клеточных типов производили подсчет в трех полях зрения, далее вычисляли среднее значение (табл. 4).

Не обнаружено значимого снижения адгезивных свойств, способности клеток к миграции и соотношения морфотипов, что указывает на отсутствие токсического действия тестируемого образца и пригодность заявляемой тест-системы. Также учитывалась доля сфероидов, подвергшихся токсическому действию (рис. 3б) по отношению к структурам с нормальной морфологией (рис. 3а). По этому показателю варианты опыта также значимо не различались, практически отсутствовали патологические формы.

В контрольных культурах наблюдалось значимое снижение адгезивных свойств мультиклеточных сфероидов и миграции клеток из сфероида (табл. 4), а также увеличивалась доля сфероидов с признаками цитотоксичности (рис. 3б), что указывает на пригодность использования тест-системы для оценки нейротоксичности.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки нейротропной и/или нейротоксической активности веществ и их композиций. Способ включает выделение спинальных ганглиев из неонатальных поросят в возрасте до 3 суток; получение из них монослойной культуры в среде альфа-MEM с 10% фетальной телячьей сыворотки крови и с добавлением антибиотика и антимикотика, пересев в концентрации 2,5-5×10³ клеток/мл на 8-10 сутки роста; или получение мультиклеточных сфероидов, образованных клетками, выделенными из спинальных ганглиев неонатальных поросят в возрасте до 3 суток, в среде альфа-MEM с заменителями сыворотки крови В27, Нейромакс и добавлением антибиотика и антимикотика; введение кратных концентраций испытуемых образцов в лунки с полученной культурой не более чем 5-го пассажа или на микроэлектродные системы, на которые помещена культура не более чем 5-го пассажа, или в лунки с мультиклеточными сфероидами в концентрации не менее 10 сфероидов диаметром 100-200 мкм на лунку, а также контрольных образцов с известным нейтротропным или нейротоксическим действием; оценку показателей пролиферативной активности клеток культуры, визуальных цитотоксических эффектов и/или электрофизиологической активности. Результат оценивают по сравнению с контрольными образцами и/или путем расчета ED₅₀ и/или LD₅₀ методом пробит-анализа. Способ позволяет оценивать широкий спектр нейротропных и/или нейротоксических препаратов. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Способ оценки нейротропной и/или нейротоксической активности веществ и их композиций, включающий выделение спинальных ганглиев из неонатальных поросят в возрасте до 3 суток; получение из них монослойной культуры в среде альфа-MEM с 10% фетальной телячьей сыворотки крови и с добавлением антибиотика и антимикотика, пересев в концентрации 2,5-5×10³ клеток/мл на 8-10 сутки роста; или получение мультиклеточных сфероидов, образованных клетками, выделенными из спинальных ганглиев неонатальных поросят в возрасте до 3 суток, в среде альфа-MEM с заменителями сыворотки крови В27, Нейромакс и добавлением антибиотика и антимикотика; введение кратных концентраций испытуемых образцов в лунки с полученной культурой не более чем 5-го пассажа или на микроэлектродные системы, на которые помещена культура не более чем 5-го пассажа, или в лунки с мультиклеточными сфероидами в концентрации не менее 10 сфероидов диаметром 100-200 мкм на лунку, а также контрольных образцов с известным нейтротропным или нейротоксическим действием; оценку показателей пролиферативной активности клеток культуры, визуальных цитотоксических эффектов и/или электрофизиологической активности; результат оценивают по сравнению с контрольными образцами и/или путем расчета ED₅₀ и/или LD₅₀ методом пробит-анализа.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют монослойную культуру или мультиклеточные сфероиды, полученные из клеток спинальных ганглиев неонатальных поросят в возрасте до 3 суток, которые были криоконсервированы с применением криопротектора ДМСО в концентрации 5-10% и разморожены.