Способ подготовки пробы культуры растительной ткани к цитометрическому анализу Советский патент 1986 года по МПК C12N5/00 

1 Изобретение относится к области технологии вьфащивания пересадочных культур растительных тканей, исполь зуемых в качестве продуцентов биоло гически активных веществ в различны отраслях промышленности: пищевой, п фомерной, медицинской, в частности способам подготовки проб к цитометр ческому анализу. Под цнтометрическим анализом кул тур растительных тканей обычно пони мают: подсчет числа клеток или плотнос клеток в суспензии,, полученных в ре зультате мацерации ткани; подсчет живых и мертвых клеток в результате витального окрашивания ткани; приготовление микропрепаратов дл определения размеров клеток, Все перечисленные составляющие цитометрического способа альтернативны . Наиболее близким по технической оснащенности является способ подготовки пробы культур растительной тк ни к цитометрическому анализу, вклю чающий обработку пробы мацерирующим раствором - 20%-ным раствором хромо вой кислоты при 60 С в течение 1520 мин (соотношение ткани и мацерирующего раствора 1:3) для определения плотности клеток. Подготовленную пробу подвергают цитометрическому исследованию. В камере Фукса-Розенталя подсчитывают среднее (из шести повторностей) число клеток в 1 мл. суспензии Затем вычисляют среднее число клеток на 1 мг сырого веса ткани и на всю ткань в пробирке. Жизнеспособность клеток оценивают по прижизненному окрашиванию пробы метиленовым синим (0,01%), приготовленным на растворе макросолей. Определяют среднее значение из трех повторностей (в сумме не менее 1000 кле ток) . Для измерения размера клеток готовят давленые или резаные микропрепараты, их окрашивают ацетоорсеином или реактивом Шиффа. Наиболее существ%нными недостатками известного способа являются жесткие условия мацерации, приводящие к тому, что часть клеток полностью разрушается или деформируется последнее ведет к значительной ошиб5ке при подсчете числа клеток и делает невозможной точную оценку жизнеспособности и размеров клеток; некоторое количество клеточных агрегатов остается неразмацерированным , что также затрудняет точный подсчет числа клеток; субъективность .оценки живой и мертвой клетки. Таким образом, из-за жесткого, недостаточно избирательного эффекта воздействия на ткани, подвергаемые цитометрическому анализу, последний характеризуется значительными ошибками в определении, а также определенной сложностью, так как он фактически состоит из трех отдельных операций . Определение жизнеспособности, числа и размера клеток требует применения различ шх, взаимоисключающих друг друга методов, для которых необходимо использовать различные пробы. Целью изобретения является обеспечение более щадящего и мягкого воздействия на клетки исследуемой ткани, т.е. предотвращение повреждения клеток и повьш1ение степени сохранения их жизнеспособности, в результате чего повышается степень точности определений при цитометрическом анализе и упрощается проведение анализа. Указанная цель достигается описываемым способом подготовки пробы культуры растительной ткани к цитометрическому анализу, заключающемся в обработке пробы мацерирующим раствором с последующим окрашиванием мацерата метиленовым синим, причем используют мацерирующий раствор следующего сотава, мае. %: Кальций хлористый 1,95-2,05 Пектиназа Г10Х 2,45-2,55 Целлокандин ГЗХ 4,95-5,05 Вода дистиллированная Остальное а обработку пробы мацерирующим раствором ведут при 2611 С в течение 45 ч при объемном соотношении пробы и мацерирующего раствора 1:1. Способ обычно осуществляют следуюим образом. Исследуемую культурную жидкость оединяют в равных количествах с маерирующим раствором. Инкубацию проодят при в течение 4 ч на каалке. После обработки суспензия остоит преимущественно из одиночных 3 сферических протопластов клеток, из небольшего числа мелких (не более 2-}О клеток) агрегатов, где можно легко проанализировать все клетки, а также из некоторого количества бе форменных мертвых клеток. Перед анализом материала в мацерирующую жидкость добавляют метиленовой синий так, чтобы концентрация его составляла 0,01%. Анализируемую суспензию помещают в гемоцитометр Фукса-Розенталя и од новременно подсчитывают жизнеспособ ность кдеток, их число (плотность суспензии) и размеры.. Описываемый способ опробован на культурах тканей корня женьшеня, листа родиолы розовой и листа лука репчатого. Пример 1. Цитометрический анализ культуры ткани по известному способу. Цитометрический анализ культуры ткани включает ряд отдельных анализов . Мацерация ткани для подсчета чис ла клеток (определение плотности су пензии) . Готовят раствор хромовой кислоты в концентрации 20%. I В пробирку помещают 100 мг каллусной ткани и добавляют 20%-ную хромовую кислоту в объеме 1:3. Мацерат помещают в термостат при температуре 60 С на 15-20 мин. Вьшув пробирку из термостата, ее несколько раз энергично встряхивают и содержимое перемешивают стеклянно палочкой. Для определения плотности суспен зии 1 мл размацерированного материа ла помещают в гемоцитометр Фукса-Ро зенталя . Под микроскопом просчитывают коли чество клеток. Плотность расчитывают по формуле 1000.у V -- - - - -- 3,2 где X - плотность суспензии; у - среднее число клеток на камеру из 6 повторностей; 3,2 - объем камеры. Определение живых и мертвых клеток. Определение жизнеспособности клеток проводят, применяя витальные красители. Краситель митиленовый синий гото вят в концентрации 0,01%-ного раств 5 а, в качестве растворителя используют раствор макроэлементов той среды, на которой выращивают культуру. Используемую суспензию клеток помещают в раствор красителя на 5 мин. Окрашенную суспензию поменяют на предметное стекло и просчитывают под микроскопом количество живых клеток (анализируют не менее 1000 клеток). Определяют из них процент живых клеток. В клеточных агрегатах определяют жизнеспособность. Определение размера клеток. Пробу ткани фиксируют в смеси абсолютный спирт: уксусная кислота.(3:1) Проводят гидролиз 0,1 н. НС1 при температуре 60 С в течение 10 мин и окрашивают по Фельгену. Готовят давленые препараты и окрашивают ацетоорсеином. Препарат закрьшают покровным стеклом, материал слегка давят. Под микроскопом измеряют два диаметра клеток. Площадь клетки определяют перемножением большого и меньшего диаметра. П р и м е р 2. Цитометрический анализ культуры ткани женьшеня по эписьшаемому способу. Готовят мацерирующий раствор следующего состава, мае. %: Хлористый кальций 2 Целлокандин Г-Зх С,(-600 (Рассказовский БХЗ)5 Пектиназа Г-10х 70 ед. (Вьшшеволочский завод ферментных препаратов) 2,5 Дистиллированная вода рН 5,0-6,0ОстальСмешивают 1 мл исследуемой культуры с мацерирующим раствором в равных объемах. Перемешивают в течение 1-2 мин для обеспечения лучшего контакта клеточной поверхности с ферментами. Пробу инкубируют в течение А ч при на качалке. Добавляют 0,1%-ный метиленовый синий в мацерат так, чтобы концентрация краски была 0,01%. Помещают полученный мацерат в ге-моцитометр Фукса-Розенталя для определения жизнеспособности, количестваи размера клеток. Определение жизнеспособности проводят путем раздельного подсчета живых неокрашенных клеток сферической формы и мертвых бесформенных, окрашенных метиленовым синим клеток. Таким образом, в анализе используются два четко регистрируемых параметра: форма клеток и их окраска, что обеспечивает его надежность. Количество клеток определяют, суммируя живые и мертвые клетки (см. табл. 1, 2 , 3). Размер клеток проводят, измеряя диаметр протопласта, расчет ведут по формуле объема шара: R Влияние концентр компонентов маце жизнеспособность клеток (культура

Концентрация компонентов, мае. %

Кальций Пекти-,Целлохлорис- наза |кандин

тый ;

0,5 1,0

0,5

Выход кле- I Жизнеспоток, %

собность, %

88,2 На чертеже изображены формы изме ряемых клеток, получаемых известным (а) и предлагаемым (б) способами. Таким образом, описьшаемый способ позволяет получать полностью размацерированную ткань и проводить точный подсчет числа клеток; одновременно с мацерацией витально окрашивать клетки для определения жизнеспособности, используя при этом два четко регистрируе1 1х параметра, форму клеток и их окраску; проводить весь анализ на одной пробе, полученные данные характеризуют параметры живых клеток в абсолютных значениях. Т а б л и ц а Г исоотнощёния ющей смеси на ыход отдельных ни женьшеня)

СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ К ЦИТОМЕТРИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ путем обработки пробы мацерирующим раствором с последующим окрашиванием мацерата метипеяо- вым синим, отличающийся .тем, что, с целью предотвращенияповреждения клеток и повышения степени сохранения их жизнестойкости, исполь зуют мацерирующий раствор следующего состава, мае. %: 1,95-2,05 Кальций хлористый 2,45-2,55 Пектиназа Г10Х 4,95-5,05 Целлокандин ГЗХ Остальное Вода дистиллированная причем обработку пробы мацерирующим раствором ведут при температуре 26±1°С в течение 4-5 ч при объемном соотношении пробы и мацерирующего раствора 1:1. (Л с О, со ;о со ел со (J о - о о Оо О СП а- упрощенные дзигурь 5- марообразные фигуры

X Нормальная жизнеспособность культуры находится в пределах 70-90%.

Статистический анализ данньрс, полученных известным и описываемым способами по определению жизнеспособности клеток (культура ткани женьшеня)

9995958

Таблица 2 Статистический анализ данных,

полученных известным и описываемым способами по определ(ению количества клеток (культура ткани женьшеня)

Данные по количеству клеток х10

,8 271 ,74 Gil 11,42 272 ,97 ,95 270 ,95

таблица 3

274

270

270

268

271

271

270