Способ получения протопластов плодовых растений Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции, в генетике и физиологии растений для получения протопластов.

Целью изобретения является повышение выхода протопластов.

Способ заключается в повышении суспензионной культуры клеток и инкубации их в растворе композиции ферментных препаратов, при этом в качестве ферментных препаратов используют пектофоетидин, целлюконингин и целлобиазу в концентрации 0,1 - 2,0% каждого. Активность ферментов при этом составляет, ед./г: пектина- за 36-40; 1,4-|1-1)-глюкан-целлобиогид- ролаза 45-50; 1,4-й-глюканаза 50-55; экзо-1,4-р -глюкозидаза 35-40; целло- биаза 180-200.

Способ осуществляется следующим образом.

В суспензионную культуру клеток вносят ферментньй раствор пектофое- тидина, целлюконингина и целлобиазы в концентрации 0,1 - 2,0%. Инкубацию проводят в термостате при 26 С в течение 16 ч. Осаждение протопластов осуществляют с помощью центрифуги.

Основное требование, предъявляемое к подбору композии ферментов, состоит в том, чтобы все вьщеленные протопласты имели шаровидную форму с равномерным распределением хлоро- пластов.

Пример 1. Испытывают влияние ферментных препаратов пектофоети- дина, целлюконингина и целлобиазьр на

количественный выход изолированных протопластов из клеток листьев смородины и каллусной ткани земляники.

Суспензионную культуру клеток смородины (сорт Память Мичурина) выделяют из розеток листьев, выращенных из апикальных меристем в условиях стерильной культуры на искусственной питательной среде

Суспензионную культуру клеток земляники (сорт Рубиновый кулон) выделяют из каллусной ткани, выращенной в условиях стерильной культуры на искусственной питательной среде.

Пектофоетидин, целлюконингин и целлобиазу (образцы промыщленных препаратов) вносят в концентрациях 1,0 и 2,0%. Опыт ставят в трехкратной повторности. В качестве контроля испытывают ферментный препарат - пекти назу (очищенную без наполнителя) в концентрации 1% Все ферменты растворяют в смеси растворов 0,4 М D- маннит, 0,3 М CaClj и 0,7 М NaHPO.

В вариантах, где применяют пекто- фоетидин, целлюконингин, и целлобиазу, почти все протопласты листа смородины и каллусной ткани земляники освобождаются от клеточных стенок и оказьшаются суспендированными в инкубационной смеси. Существенных различий по количественному выходу изолированных протопластов от применения каждого из этих ферментов не наблюдается.

Выход жизнеспособных протопластов из 1,0 г листовой ткани смородины при использовании пектофоетиди- на составляет 7,5-10 п./мл, при использовании целлюконингина - 5,8 10 п./мл, при применении целлобиа- зы - 6, п./мл (табл. 1),

На таком же уровне наблюдается содержание изолированных протопластов в контроле f1,0- 10 п„/мл), где применяют пектиназу.

Содержание изолированных протопластов из клеток,каллусной ткани земляники при использовании гГектофое тидина, целлюконингина и пектиназы

составляет 1,210 п./мл, а при использовании целлобиазы - 1,010 п,/мл.

Данные опыта показывают, что предлагаемые ферменты - пектофоетидин.

целлюконингин и целлобиаза обладают комплексом ферментных систем, активно разрушающих клеточные стенки плодовых культур и способствую10

5

0

5

0

5

0

5

0

.

5

щих получению жизнеспособных протопластов, причем эффективность ферментов значительно выше, чем в известных способах (табл. 2-4).

Таким образом, предлагаемый способ получения протопластов расщиря- ет использование композиции из цел- люлолитических и пектолитических ферментов, которые могут с успехом заменить импортные препараты при получении протопластов плодовых культур, а также снижаются затраты времени и денежных средств.

Для доказательства жизнеспособности протопластов используются такие красители, как трипсиновый синий или метиленовый синий. Отбирается часть окрашенной суспензии протопластов (равньм объем суспензии протопластов и 0,1%-ного трипсинового синего), пастеровской пипеткой за- полняется сетчакая камера Фукса-Ро- зенталя, определяется концентрация живых протопластов в исходной суспензии,Окращенные протопласты нежизнеспособны. Жизнеспособные протопласты не окрашиваются.

Результаты проведенных исследований показали, что после первого дня культивирования жизнеспособность протопластов, выделенных из клеток листовой ткани смородины сорта Память Мичурина, под влиянием ферментов - пектиназы, пектофоетидина, целлюконингина и целлобиазы различается в пределах 70-80%, У других видов и сортов смородины (Rubus americanicum и сорт Голубка) жизнеспособность протопластов находится на уровне 60-80%,

Жизнеспособность протопластов, выделенных из клеток каллусной ткани земляники сорта Рубиновый кулон составляет более 90% протопластов, У других видов и сортов земляники (Fragaria raaschata и Фестивальная) жизнеспособность протопластов 60-90%,

Указанные ферменты положительно используются в работах по выделению других видов плодовых растений (яблоня и груша).

При оптимальных условиях культивирования протопласты регенерируют клеточную стенку, клетки делятся с образованием клеточных колоний и формируют каллусные тканио Успешно вы- леленные протопласты под влиянием ферментов - пектиназы, пектофоетидина, целлюконингина и целлобиазы используются в исследованиях по соматической гибридизации (гибридизация клеток методом слияния изолированных протопластов).

Формула изобретения

Способ получения протопластов пло- довых растений, включающий получение суспензионной культуры клеток и инкубацию их в растворе композиции ферментных препаратов, отличающийся тем, что, с целью повы-

шения выхода протопластов, в качестве ферментных препаратов используют пектофоетидин, целлюконингин и целло- биазу в концентрации 1,0 - 2,0% каждого, причем активность ферментов при этом составляет, ед./г:

Пектиназа

1 , А-|5-1)-Глюкан- целлобиогидролаза 1,4-р-Глюканаза Экзо-1,4-15-глюко- зидаза Целлобиаза

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в генетике, селекции, физиологии и клеточной инженерии растений. Целью изобретения является повышение выхода протопластов. Способ состоит в использовании для гидролиза клеточных стенок растений новой композиции пектолитических и целлюлолитических ферментов. Способ позволяет получить большое количество протопластов с высоким содержанием жизнеспособных, пригодных для нужд клеточной селекции. При этом используются ферменты микробного происхождения, что позволяет обходиться без дорогостоящих импортных ферментов. 4 табл.

1,0-10

7,5«10 5,840

6,4-10 1,210

1,2-10 1,240 1,010

Таблиц

7,0.10

Псктнназа (очшеннал Веэ наполнителя)

То же

8,1-10

Пектофое- тидин

6,8-10 Целликонин- гин

7,710 Цеплобиаэа

Таблица 2

Таблица 3

,5 Обвая пектинаэная

активностьАО

ЦеллобиогидролаэаА2

Эндо-глпканаэаS2

Экэо-глюкоэндаэа.38

Целлобиааа185

,5 ООвая пвктинаэная

активностьАО

ЦеллобногидролаэаАЗ

Эндо-глюкаэцааза50

Целлобиаза150

,0 Целлобногидролаэа50

Эн;,о-глюканаэа55

Экэо-глюко31щазаАО

,0 ЦеллобиогиАролаза50

Эндо-глюканаза55

Зкзо-глюкозидазаАО

О,АН О-Маннит 0,ЗН СаС1( 0,7М НаНРО«

То же

16

16

16

16

1527258

10 Продолжение табл.3

Тавлнца 4