СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ СУММАРНОЙ РНК Российский патент 1995 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской паразитологии и вирусологии, способам индикации возбудителей инфекционных болезней в клещах-переносчиках и может быть использовано в учреждениях, занимающихся индикацией вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).

Известны способы детекции ВКЭ в яйцекладках иксодовых клещей с помощью заражения чувствительных животных суспензией из яиц [1] или предварительного заражения голодных иксодовых клещей суспензией из яиц, их инкубации при 20-22^оС и уже последующего заражения чувствительных животных. Однако первый из них малоэффективен, второй требует для своего выполнения лабораторную линию клещей, достоверно не зараженных ВКЭ, что связано с определенными затруднениями. Кроме того, эти способы не только трудоемки, но и длительны по выполнению. Для получения конечного результата уходит две и более недели.

В последние годы для диагностики различных вирусных инфекций [2] в том числе и для ВКЭ [3] стал использоваться способ молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, позволяющий детектировать РНК ВКЭ в крови и индивидуальных клещах без использования лабораторных животных. Однако в литературе не найдено сообщений о возможности детекции РНК ВКЭ в яйцекладках клещей-переносчиков, способах получения суммарной РНК, позволяющих достаточно полноценно выделить и РНК ВКЭ в составе полученного препарата.

Целью изобретения является повышение эффективности способа получения препаратов суммарной РНК для последующего выявления и определения количественного содержания вирусной РНК, снижение трудоемкости и сокращение времени исследования.

Это достигается тем, что препараты суммарной РНК из суспензии, приготовленной из пробы яиц кладки иксодовых клещей, выделяют из однородной суспензии, полученной в режиме замораживания-оттаивания в жидком азоте в лизирующем буфере, с последующей фенольной депротеинизацией и осаждением РНК, в качестве лизирующего буфера используют состав с рН 7,5, содержащий, г/л: трис(гидрометил)аминометан 6,06; додецилсульфат натрия 5; бентонит 0,002.

Способ осуществляется следующим образом.

Пробы яйцекладок иксодовых клещей (по 75-100 яиц в пробе) гомогенизируют в полипропиленовой пробирке с помощью предварительно охлажденного в жидком азоте стального пестика, замораживая и размораживая до получения однородной суспензии в 100 мкл лизирующего раствора следующего состава, г/л: трис(гидрометил)аминометан 6,06; додецилсульфат натрия 5, бентонит 0,002. Полученную суспензию заливают равным объемом фенола, насыщенного 50 мМ раствором ацетата натрия рН 5,2; прогревают 10-15 мин при 56^оС, периодически перемешивая, затем охлаждают 5 мин при -20^оС, центрифугируют 2-3 мин при 10000 об/мин. Верхнюю водную фазу, содержащую РНК, аккуратно отсасывают и заливают 2,5-3,0 объемами этанола с добавлением ацетаа натрия рН 5,2 до концентрации 0,2 М. После инкубации при -20^оС в течение 18 ч полученные пробы центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин, осадок промывают 100 мкл этанола, подсушивают на воздухе и растворяют в 50 мкл деионизированной стерильной воды. К 10 мкл раствора РНК добавляют равный объем 15% формальдегида, прогревают 10 мин при 56^оС, добавляют 20 мкл 3 М хлорида натрия с 0,3 М цитрата натрия (рН 7,0) и наносят на нитрицеллюлозные фильтры. Иммобилизацию РНК на фильтрах проводят при 80^оС в течение 2 ч в вакуумном сушильном шкафу. Детекцию РНК ВКЭ в полученных пробах суммарной РНК проводят с помощью гибридизации с плазмидами рBR 322 ДНК ВКЭ, меченных ³²Р, и последующей авторадиографии. Количество вирусной РНК в пробе определяют, сравнивая полученные сигналы с сигналами, соответствующими 1 пг, 10 пг, 100 пг и 1 нг РНК ВКЭ.

П р и м е р 1. От напитавшейся самки Iхоdes persulcatus, cнятой с собаки в природном очаге КЭ, получено 7 проб яйцекладок (1-34 дни от начала яйцекладки). Из каждой пробы яйцекладок отбирали 75-100 яиц (4-6 мг), получали суспензию в лизирующей смеси (50 мМ трис-НСl рН 7,5; 0,5% додецилсульфат натрия; 0,0002% бентонит), выделяли суммарную РНК методом фенольной депротеинизации (фенол, насыщенный 50 мМ раствором ацетата натрия рН 5,2; 10 мин при 56^оС). РНК из водной фазы после охлаждения пробы при -20^оС в течение 5 мин и центрифугирования при 10000 об/мин в течение 2-3 мин осаждали добавлением 2,5-3,0 объемов этанола с 0,2 М ацетата натрия при -20^оС в течение 18 ч. После центрифугирования при 10000 об/мин в течение 5 мин осадок РНК промывали 10 мкл этанола, подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл деионизированной стерильной воды. К 10 мкл раствора РНК добавляли 10 мкл 15% -ного раствора формальдегида, прогревали 10 мин при 56^оС, добавляли равный объем 3 М хлорида натрия с 0,3 М цитрата натрия и наносили на нитроцеллюлозные фильтры. Фильтры отжигали при 80^оС в вакуумном сушильном шкафу в течение 2 ч. Гибридизацию с плазмидами ³²Р рВR 322 ДНК ВКЭ проводили в течение ночи. После отмывания фильтров, подсушивания и авторадиографии с рентгеновской пленкой (РМ-В. "Тасма", СССР) вирусная РНК детектирована во второй пробе яиц (1-10 пг), третьей (50 пг) и пятой (50 пг). В первой, четвертой, шестой и седьмой пробах яйцекладки вирусная РНК не определена.

П р и м е р 2. От напитавшейся самки Haemophysalis concinna, снятой с собаки в природном очаге КЭ, получено 4 пробы яйцекладок (3-25 дни от начала яйцекладки). После выделения суммарной РНК, нанесения проб на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизации с ³²Р рBR 322 ДНК ВКЭ вирусная РНК определена в первых двух пробах (3 и 7 дни от начала яйцекладки) в количестве 50 пг. В пробах 12 и 25 дня от начала яйцекладки РНК вируса КЭ не определена.

Для сравнения было проведено параллельное исследование этих же яйцекладок по известной методике [1] Вирус не был выделен при проведении двух последующих пассажей.

Предлагаемый способ получения препаратов РНК из яйцекладок иксодовых клещей позволяет полноценно выделить вирусную РНК в составе суммарной РНК и провести ее индикацию с помощью метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, определить количество вирусной РНК в пробе, одновременно исследовать большое число проб и сократить время проведения анализа до 48 ч.

Использование: изобретение относится к области медицинской паразитологии и вирусологии, способам индикации возбудителей инфекционных болезней в клещах-переносчиках и может быть использовано в учреждениях, занимающихся индикацией вируса клещевого энцефалита. Сущность изобретения: выделение препаратов суммарной РНК из яйцекладок иксодовых клещей проводят в режиме замораживания оттаивания в жидком азоте, используя лизирующий буфер следующего состава, г/л: трис(гидрометил)аминометан 6,06; додецилсульфат натрия 5; бентонит 0,002, с последующей фенольной депротеинизацией и спиртовым осаждением. В полученных пробах суммарной РНК проводят индикацию вирусной РНК методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с помощью гибридизации в рекомбинатных плазмидах ³²P рВР 322 ДНК ВКЭ и радиоавтографии с рентгеновской пленкой.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ СУММАРНОЙ РНК из суспензии, приготовленной из пробы яиц кладки иксодовых клещей, включающий получение однородной суспензии в лизирующем буфере с последующей фенольной депротеинизацией и осаждением РНК, отличающийся тем, что в качестве лизирующего буфера используют состав (г/л) с рН 7,5, содержащий трис (гидрометил) аминометан 6,06, додецилсульфат натрия 5, бентонит 0,002, а суспензию получают в режиме замораживания-оттаивания.