СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ Российский патент 1994 года по МПК C12N11/14 C12N11/10 

Изобретение относится к получению иммобилизованных ферментов, в частности пероксидаз. Иммобилизованные пероксидазы применяются для стерилизации пищевых и медицинских жидкостей, для предотвращения роста микроорганизмов в реакторах.

Известен способ получения иммобилизованной пероксидазы на альгинатном волокне.

Недостатком способа является низкая активность иммобилизованной пероксидазы, кроме того, материал носителя непрочен, подвержен микробиологической атаке.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения иммобилизованной пероксидазы обработкой полимерного носителя на основе модифицированного полистирола водным раствором пероксидазы хрена в присутствии бикарбоната натрия при 0-4^оС с продолжительностью процесса 20 ч.

Недостатком указанного способа является низкая удельная активность иммобилизованной пероксидазы, длительность и многостадийность процесса иммобилизации.

Цель изобретения - повышение удельной активности препарата иммобилизованной пероксидазы.

Цель достигается тем, что для увеличения удельной активности иммобилизованной пероксидазы проводят модифицирование кремнеземного носителя - аэросила 2-3% -ным раствором декстрана с последующим окислением продукта перхлоратом натрия.

Существо предлагаемого способа в активировании аэросила декстраном, представляющем собой полисахарид - линейный полимер на основе глюкозы, в котором звенья связаны α = 1,6-гликозидной связью. При последующем окислении модифицированного носителя раствором перхлората получаемый продукт активирован альдегидными группами, способными к взаимодействию с молекулами фермента пероксидазы.

П р и м е р 1. 10 г аэросила суспендируют в 100 мл 4% -ного водного раствора декстрана. Смесь выдерживают при комнатной температуре 1 ч. Полученный носитель далее высушивают при 100-120^оС в течение 1 ч. К полученному аппарату добавляют 50 мл водного раствора, содержащего 3 г перхлората натрия, и ингибируют в течение 30 мин. Затем носитель отмывают 250 мл дистиллированной воды. К 1 г носителя приливают 10 мл ацетатного буфера рН 4,8, содержащего 0,03 г пероксидазы. Смесь оставляют в течение 1 ч при 4^оС, далее надосадочную жидкость сливают, а носитель промывают трижды по 30 мл ацетатным буфером рН 4,8. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,86 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 98% активность по отношению к нативному состоянию.

П р и м е р 2. Способ получения иммобилизованной пероксидазы осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 3% -ный раствор декстрана. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,86 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 96% активности по отношению к нативному состоянию.

П р и м е р 3. Способ получения иммобилизованной пероксидазы осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 2% -ный раствор декстрина. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,72 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 98% активности по отношению к нативному состоянию.

П р и м е р 4. Способ получения иммобилизованной пероксидазы осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 1% -ный раствор декстрана. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,43 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 98% активности по отношению к нативному состоянию.

П р и м е р 5. Способ получения иммобилизованной пероксидазы осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 2,5% -ный раствор декстрана. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,78 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 96% активности по отношению к нативному состоянию. В отличие от прототипа предлагаемый способ иммобилизации повышает удельную активность фермента пероксидазы в 3-4 раза.
Как видно из таблицы для модифицирования аэросила оптимален раствор декстрана с концентрацией 2-3% . При увеличении концентрации до 4% не наблюдается увеличение активности иммобилизованной пероксидазы, тогда как уменьшение до 1% снижает значение удельной активности фермента.

Положительный эффект и преимущества предлагаемого способа получения иммобилизованной пероксидазы в том, что в процессе гелеобразования в водном растворе непористого кремнезема аэросила в присутствии органического вещества декстрана образуется органо-минеральный носитель, имеющий пористую структуру. В процессе формирования пористой структуры кремнеземной матрицы происходит активирование поверхности органическим полимером-декстрином. Последующее поверхностное окисление функциональных групп декстрана приводит к образованию химически активных альдегидных групп, которые реагируют с молекулами фермента пероксидазы при иммобилизации. Кремнеземный носитель используемый для иммобилизации пероксидазы, обеспечивает повышение удельной активности иммобилизованного препарата, кроме того, выгодно отличается механической, химической, микробиологической и термической устойчивостью. (56) Авторское свидетельство СССР N 742434, кл. С 12 N 11/10, 1980.

Патент США N 3860486, кл. 195-68, опублик. 1975.

Использование: биотехнология, может быть использовано для стерилизации пищевых и медицинских жидкостей. Сущность изобретения: способ предусматривает использование в качестве носителя аэросила, модифицированного декстраном, представляющим собой полисахарид - линейный полимер на основе глюкозы, в котором звенья α связаны глюкозидной связью. При последующем окислении продукта раствором перхлората носитель активирован альдегидными группами, способными к взаимодействию с молекулами фермента пероксидазы. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ, предусматривающий взаимодействие ферментсодержащего раствора с модифицированным носителем, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности фермента, в качестве носителя используют аэросил, модифицированный 2 - 3% -ным раствором декстрана и окисленный перхлоратом натрия.