Способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов Советский патент 1984 года по МПК C12N11/14 

00

СлЭ Изобретение относится к способам получения иммобилизованных ферментов, которые могут быть использован в медицинской промышленности для приготовления биопрепаратов. Известен способ иммобилизации ферментов путем модифицирования поверхности неорганического носителя магнийорганическим соединением в среде абсолютированного эфира с последующим ковалентным связьшанием фермента m. Недостатками этого способа являются многостадийность процесса и сложность обработки неорганического носителя магнийорганическим соедине нием, что ограничивает практическое использование иммобилизованных препаратов в промышленных целях. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов, включающий модификацию активированного аминопроOCgHffS -0-5-;-fCH).-NH, .2.

CEOi 2% S-i-O-S-i - (СИд}-С

осгН5 , в. 5н -о -s-i - (. ОС2Н5 предлагаемая схема реакции подтверждена данными химического анали за продуктов модификации (табл.1) и результатами инфракрасной спектро скопии исходных и модифицированных кремнеземов. Оптимальными условиями диазотирования является добавление к активированному носителю 1,9-7,5%-н го раствора азотистокислого натрия (5-20-кратньш избыток реагента по отношению к количеству аминопропиль ных групп)(табл.2). При проведении реакции диазотирования уменьшение концентрации раствора NaN02 нецелесообразно, поскольку ведет к значительному количеству аминопроNH2 -фермент пилтриэтоксисиланом кремнеземного носителя путем обработки последнего глутаровым альдегидом и последующее связывание фермента 2j, К недостаткам способа следует отнести невысокую активность целевого продукта ( 50%). Цель изобретения - увеличение активности целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованных протеолитических ферментов, включающему модификацию активированного аминопропилтриэтоксисиланом кремнеземного носителя и последующее связьшание фермента, модификацию проводят диазотированием активированного носителя 1,9-7,5%-ньм раствором азотистокислого натрия и последующего окисления 2-5%-ным раствором перхлората натрия или периодата калия. Химическая модификация осуществляется по следующей схеме: OCgHj . S-i-0-S-i - (СН2)2-СИ2-ОН OC2H5 - фермент пильньрс групп, не вступавших в реакцию. Увеличение концентрации NaNOg, не создает дополнительных преимуществ. Оптимальный интервал варьирования концентрации раствора NaCIO или ООц находится в пределах 2,0-5%-ного раствора или 1-6-кратный избыток реагента по отношению к количеству оксипропильных групп носителя (табл.3). Как видно из таблицы, применение для окисления концентрации раствора NaCjO CKDO) равной 0,6% нецелесообразно, поскольку приводит к значительному количеству непрореагировавших оксипропильных групп. Увеличение концентрации NaClQ () свыие 5% дает тот же эффект, как и при использовании 2-3%-ного раствора.

При иммобилизации на полученных носителях протеолитичёских ферментов (папаина или пепсина) активность целевого продукта на 30-40% вьше, чем при иммобилизации известным способом (таблица 4) .

Пример 1. Получение носителя 10 г макропористого кремнезема, высушенного при , обрабатывают парами аминопропилтриэтоксилна в течение 3 ч при 120 С в токе осушенного газа носителя (воздзгх) , после чего прддукт промывают тремя порциями по 50 мл ацетона,К аминированному носителю прибавляют 50 МП раствора IN NaC и постепенно добавляют 30 мл 20%-ного водного раствора NaNO, (достигается 20-кратный избыток реагента по отношению к аминопропильным группам, необходимость избытка реагента обусловлен неустойчивостью азотистой кислоты, конечная концентрация NaNOg- 7,5%). Суспензию выдерживают в течение 60 мин при комнатной температуре, послечего надосадочную жидкость сливают, промывают носитель в 200 мл дистиллированной воды. Как видно из табл.2 в этом случае 90% ковалентно связанных с кремнеземом аминопропильных групп при диазотировании превращаются в оксипропильные, При концентрации NaNO равной 1,9%, количество оксипропильных групп несколько снижается. К полученному препарату добавляют 50 мл водного раствора, содержащего 2,5 г (5%-ный раствор) и перемешивают в течение 1 ч. Затем носитель отмывают в 200 мл (4-крат. ная обработка по 50 мл) дистиллированной водой. Достигается 6-кратньй избыток окисляющего реагента по отношению к оксипропильным группам носителя, что обеспечивает, в соответствии с результатами табл.3, прак тически 10р%-ное превращение данных групп в альдегидные. , К 2 г полученного носителя приливают 30 мл ацетатного буфера рН 4,0 содержащего 0,6 г пепсина. Смесь оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее надосадочную жидкость сливают, а носитель промывают ацетатным буфером рН 4,0 до отсутствия следов белка в промывках

водах. Количество пепсина, иммобили зованного на 1 г носителя, равно 66 мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 95% активности по отношению к нативному состоянию.

Пример 2. Аминирование кремнезема проводят аналогично примеру 1. Для диазотирования к аминосодержащему носителю прибавляют 50 мл раствора IN НСр и постепенно добавляют 30 мл 10%-ного водного раствора NaN02 (достигается 10-кратный избыток реагента, конечная концентрация 3,7%). В соответствии с дaнны и химического анализа также как и в примере N- 1 , практически 90% ковалентно связанных с кремнеземом аминопропильных групп при диазотировании превращаются в оксипропильные (табл.2). Далее к носителю с оксипропильными группами добавляют 30 мл водного раствора, содержащего 1,0 г (2%-ный ра;створ) и перемешивают в течение 1 ч. Затем носитель отмьюают в 200 мл (4-кратная обработка по ,50 мл) дистиллированной воды. Достигается 2,5-кратный избыток окисляющего реагента по отношению к оксипропильным группам носителя, что обеспечивает, по данным химического анализа, практически 100%-ное превращение данных групп в альдегидные, К 2 г носителя, полученного по примеру 1, приливают 30 мл фосфатного буфера рН 6,8, содержащего 0,5 г папаина. Смесь перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее надосадочную жвдкость сливают, а носитель промывают фосфатным буфером рН 6,8 до отсутствия следов белка в промьшных водах. Количество папаина иммобилизованного на 1 г носителя равно 63 мг. Иммобилизованньш фермент сохраняет 82% активности по, отношению к нативному состоянию. Как видно из табл.4 предлагае1мьй способ по сравнению с известным обеспечивает увеличение на 30-40% протеолитической активности фермента в иммобилизованном состоянии. Использование предлагаемого изобретения позволяет получать препараты с более высокой активностью, что увеличивает эффективность их использования в технологических процессах. Химический состав продуктов диазотироаания и окисления кремнеземов с алифатическими аминогруппами 1Таблица

СПОСОБ ПОЛУЧЕШ1Я ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, включающий модификацию активированного аминопропшттриэтоксисиланом кремнеземного носителя и последующее связьшание с ферментом, отличающийся тем, что, с целью увеличения активности целевого продукта, модификацию проводят диазотированием активированного носителя 1,9-7,5%-ным раствором азотистокислого натрия и последующего окисления 2-5%-ным раствором перхлората натрия или периодата калия.

Пределы варьирования концентрации раствора лого натрия Т а б л и ц.а 2 азотистокисСравнительная характеристика предлагаемого и способов ш мобилизации ферментов

41,6

76,9

63,0

66,0

52,0

63,00 .

53,9

831

95,0

1260

82% Таблица4 известного