СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ УРЕАЗЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N11/14 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованной уреазы, и может найти применение в аналитической промышленности (создание ферментных электродов) при очистке сточных вод от мочевины.

Известен способ получения иммобилизованной уреазы (АС 1373730, опубл. 15.02.88), заключающийся в увеличении стабильности фермента при хранении после его связывания с окисленным углем в присутствии стероидных гликозидов. Недостатком способа является значительное увеличение активности исходной уреазы (более 100%), что может быть связано с влиянием самих гликозидов на ход ферментативной реакции.

Следующий способ получения иммобилизованной уреазы состоит в связывании фермента с окисленным активированным углем, модифицированным четыреххлористым титаном (АС 1090715, опубл. 07.05.84). Недостатками являются невысокий процент связывания фермента с носителем и небольшой срок сохранения активности ферментного препарата.

Наиболее близким к предполагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения иммобилизованной уреазы, заключающийся в связывании фермента с неорганическим носителем, активированным γ-аминопропилтриэтоксисиланом и глутаровым альдегидом (АС 925183, опубл. 15.10.82). Недостатком является использование вредных веществ в качестве модификаторов поверхности неорганического носителя, длительность и многостадийность процесса иммобилизации, а также невысокая величина удельной активности иммобилизованной уреазы при низком диапазоне термостабильности.

Задачей изобретения является увеличение удельной активности и диапазона термостабильности иммобилизованной уреазы при оптимуме рН с высоким процентом связывания фермента с носителем и упрощении процесса иммобилизации фермента.

Поставленная задача решается способом, включающим иммобилизацию фермента уреазы на неорганическом носителе - аэросиле, поверхность которого модифицирована природным высокомолекулярным соединением - казеином.

Способ осуществляют следующим образом. К 5 г аэросила добавляют 50 мл дистиллированной воды и перемешивают его с казеином, взятым в количестве 3-15 мас.% и растворенным в 10 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Полученную суспензию оставляют созревать при комнатной температуре в течение 24 часов. Формирование жесткого остова носителя проводят при тщательном перемешивании в течение 1 часа при температуре 110-130°С. Полученный носитель просеивают через сито с размером ячеек 230 мкм и пятикратно отмывают дистиллированной водой по 100 мл до рН промывных вод 7,0. Для иммобилизации используют фермент уреазу, выделенную из бобов сои, с удельной активностью 3460 Е/г. К 1 г влажного носителя добавляют 2,0 мл раствора фермента в фосфатно-солевом буфере рН 7,0 с концентрацией уреазы 4,0 мг/мл. Объем раствора фермента был выбран с учетом полной смачиваемости носителя. Концентрация фермента обусловлена возможностью более полного проведения процесса иммобилизации. Раствор фермента с концентрацией менее 4,0 мг/мл использовать нецелесообразно, т.к. будет иметь место неполная нагрузка фермента на носитель. Увеличение концентрации фермента выше 4,0 мг/мл недопустимо в связи с конкуренцией молекул уреазы за право обладать центрами связывания, находящимися на поверхности носителя. Иммобилизацию проводят в течение 24 часов при температуре 4°С. Время иммобилизации обусловлено процессом полного связывания фермента с носителем. Температура иммобилизации выбрана с учетом максимального сохранения активности нативного фермента. По завершению процесса иммобилизации носитель с иммобилизованным ферментом отмывают трехкратно бидистиллированной водой объемом по 50 мл до полного удаления несвязавшегося фермента, что фиксируют на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм против бидистиллированной воды. Активность нативного и иммобилизованного фермента оценивают фотоколориметрическим методом. В качестве субстрата используют раствор мочевины в фосфатном буфере. Для установления оптимума рН-активности иммобилизованной уреазы ферментативную реакцию проводят в фосфатном буфере при рН 5,4-7,0. Предел термостабильности иммобилизованной уреазы устанавливают по значениям наибольшей активности фермента при проведении ферментативной реакции в интервале температур от 10 до 60°С, так как ниже 10°С ферментативная реакция не протекает, а выше 70°С фермент теряет активность в результате процесса денатурации. За единицу уреазной активности принимается такое количество фермента, в результате реакции которого с субстратом выделяется 1 мкмоль аммиака за 1 минуту при 20°С.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. К 5 г аэросила добавляют 50 мл дистиллированной воды и перемешивают его с казеином, взятым в количестве 3 мас.% и растворенным в 10 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Полученную суспензию оставляют созревать при комнатной температуре в течение 24 часов. Формирование жесткого остова носителя проводят при тщательном перемешивании в течение 1 часа при температуре 110-130°С. Полученный носитель просеивают через сито с размером ячеек 230 мкм и пятикратно промывают дистиллированной воды по 100 мл до рН промывных вод 7,0. Для иммобилизации используют фермент уреазу, выделенную из бобов сои, с удельной активностью 3460 Е/г. К 1 г влажного носителя добавляют 2,0 мл раствора фермента в фосфатно-солевом буфере рН 7,0 с концентрацией уреазы 4,0 мг/мл. Иммобилизацию проводят в течение 24 часов при температуре 4°С. По завершению процесса иммобилизации носитель с иммобилизованным ферментом отмывают трехкратно бидистиллированной водой объемом по 50 мл до полного удаления несвязавшегося фермента. Активность иммобилизованного фермента оценивают фотоколориметрическим методом. В качестве субстрата используют раствор мочевины в фосфатном буфере при рН 7,0. Ферментативную реакцию проводят при температуре 20-60°С. Получают препарат иммобилизованной уреазы с удельной активностью 3391 Е/г носителя, что составляет 98% сохранения исходной активности при 70%-ном связывании фермента.

Пример 2. Выполняют аналогично примеру 1, за исключением того, что для модификации поверхности носителя используют казеин в количестве 5 мас.%, а в качестве субстрата используют раствор мочевины в фосфатном буфере рН 5,4. Ферментативную реакцию проводят при температуре 10-30°С, получают препарат с удельной активностью 3460 Е/г носителя, что составляет 100% сохранения исходной активности при 63%-ном связывании фермента.

Пример 3. Выполняют аналогично примеру 1, за исключением того, что для модификации поверхности носителя используют казеин в количестве 15 мас.%, а в качестве субстрата используют раствор мочевины в фосфатном буфере рН 5,4. Ферментативную реакцию проводят при 10-20°С, получают препарат с удельной активностью 3460 Е/г носителя, что составляет 100% сохранения исходной активности при 83%-ном связывании фермента.

В таблице представлены сравнительные характеристики иммобилизованной уреазы в сопоставлении с прототипом.

Таблица
Сравнительные характеристики иммобилизованной уреазыСпособ получения иммобилизованной уреазыУдельная активность фермента уреазы, Е/г сорбентаПроцент связывания уреазы, %Сохранение активности иммобилизованной уреазы, %Оптимум рНОптимум термостабильности, °СИзвестный способ340075887,318По примеру 1 (предлагаемый)339170986,020-60По примеру 2 (предлагаемый)3460631005,410-30По примеру 3 (предлагаемый)3460831005,410-20

В отличие от прототипа предлагаемый способ иммобилизации уреазы позволяет увеличить удельную активность фермента и его диапазон термостабильности при оптимуме рН с высоким процентом связывания фермента с носителем, что достигается путем его иммобилизации на кремнеземе - аэросиле, поверхность которого модифицирована казеином. Кроме того, предложенный способ исключает использование вредных компонентов в качестве модификаторов поверхности носителя и делает процесс иммобилизации фермента более простым, так как исключает проведение ряда стадий, которые могут существенно понижать активность иммобилизованного фермента.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания ферментных электродов при очистке сточных вод от мочевины. Способ предусматривает иммобилизацию фермента на неорганическом носителе - аэросиле, поверхность которого модифицирована казеином. Изобретение позволяет повысить удельную активность фермента, повысить диапазон термостабильности иммобилизованной уреазы, повысить процент связывания фермента с носителем, упростить процесс иммобилизации фермента. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения иммобилизованной уреазы, предусматривающий иммобилизацию фермента на модифицированном неорганическом носителе, отличающийся тем, что в качестве неорганического носителя используют аэросил, модифицированный казеином.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют аэросил, модифицированный путем перемешивания с казеином, взятым в количестве 3-5 мас.% и растворенным в 10 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия, в течение 1 ч при температуре 110-130°С.