СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА Российский патент 1994 года по МПК C07K3/02 C07K3/18 C07K13/00 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения плацентарного протеина овцы -2(ППО-2).

В литературе этот белок не описан и способов его получения к настоящему времени в доступной патентной и медицинской литературе не найдено.

ППО-2 был выявлен в экстрактах ткани раннего хориона овцы (котиледоне) при сроках гестации до 10 недель. При иммунохимическом исследовании методом двойной радиальной иммунодиффузии с различными биологическими жидкостями и экстрактами тканей ППО-2 отсутствовал в плазме барана, суягной овцы и эмбриональной сыворотке, а также в экстрактах ткани матки, гипофиза, надпочечника, яичка, яичника, почки, печени, селезенки, легкого. Иммунохимически данный антиген был обнаружен в тканях плаценты (котиледоне и карункуле) на всем протяжении гестации, причем, содержание его в ранней плаценте превышало таковое в терминальной в 5 раз. ППО-2 обнаруживался в равных количествах как в материнской, так и в плодной частях плаценты. Содержание его в этих тканях составило около 0,4 мг на 100 г ткани ранней плаценты.

Полученные данные позволяют предположить, что ППО-2 является плацента-специфическим антигеном и может быть использован как маркер для ранней диагностики суягности овцы и мониторинга процесса гестации у этого животного. Создание высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППО-2 в биологических жидкостях и тканях на основе очищенного препарата этого белка будет способствовать решению этой задачи.

Для получения моноспецифических поликлональных антисывороток к ППО-2 ткань плодной части ранней плаценты овцы (котиледон) гомогенизировали в равном объеме трис-глицинового буфера (0,05 М, рН 8,5), добавляя 0,1% -ный раствор детергента тритон Х-100, троекратно замораживали и оттаивали, центрифугировали, супернатант диализовали 48 ч против 0,1 М аммоний-бикарбонатного буферан и лиофилизировали. Кроликов иммунизировали пятикратно, подкожно, вводя каждому животному по 100 мг препарата белков раннего хориона в смеси с полным адъювантом Фрейнда с интервалом в 3 дня. Первую реиммунизацию проводили на 30-й день после последней иммунизации, вторую - на 90-й день после последней иммунизации. Антисыворотки удовлетворительного качества были получены лишь после второй реиммунизации. Полученные антисыворотки абсорбировали плазмой барана, экстрактами почки, печени и селезенки. С помощью этих атисывороток в ткани ранней плаценты овцы был идентифицирован антиген с подвижностью альфа1-глобулина в агаровом геле.

Целью изобретения является получение очищенного препарата плацентарного протеина-2, достигаемое следующим образом: плодную часть (котиледон) 10-12-недельной плаценты овцы гомогенизируют с двукратным количеством 0,1 М трис-глицинового буфера, рН 7,7-8,7, гомогенат центрифугируют, супернатант диализуют против 0,02-0,05 М трис-НСl буфера, рН 7,7-8,7, повторно центрифугируют и используют в аффинной хроматографии на иммобилизованной через трихлортриазин эпсилон-аминокапроновой кислоте, связавшиеся белки элюируют 2,0-4,0 М раствором хлорида калия, элюат осаждают при 90% насыщении сульфатом аммония, центрифугируют и осадок фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в 0,1 аммоний-бикарбонатном буфере, рН 8,15, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и лифилизируют, получая препарат ППО-2 50% -ной степени чистоты.

Сорбент синтезировали следующим образом. 100 мл сефарозы 6В отмывали на фильтре 1 л дистиллированной воды, слегка отжимали, переносили в химический стакан, заливали 100 мл ацетона, добавляли 1,5 г трихлортриазина, тщательно перемешивали, добавляли по каплям 10% -ный раствор едкого натра, доводя рН до 8,5. После достижения рН 8,5 прекращали добавление едкого натра, выжидали 5 мин и добавляли пятьдесят мл 50% -ного водного раствора уксусной кислоты, тем самым прекращая реакцию. Полученную проактивированную сефарозу вновь отмывали на фильтре 1 л 50% -ного водного раствора ацетона от несвязавшегося трихлортриазина и дополнительно 1 л дистиллированной воды; далее сефарозу переносили в химический стакан, добавляли 100 мл дистиллированной воды, 2 г эпсилон-аминокапроновой кислоты и 2 г бикарбоната натрия, ставили на магнитную мешалку на ночь при медленном перемешивании. На следующий день полученный сорбент - сефарозу с иммобилизованной эпсилон-аминокапроновой кислотой отмывали 3 л дистиллированной воды на фильтре, после чего сорбент был готов к употреблению.

Новым в предлагаемом способе является то, что для выделения и очистки из сложной белковой смеси ранее неизвестного белка - плацентарного протеина - 2 овцы использован биоспецифический для данного белка лиганд - эпсилон-аминокапроновая кислота, иммобилизованная на нерастворимой матрице - сефарозе, причем элюат, содержащий ППО-2, фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в летучем буфере, решая тем самым одновременно две задачи: дополнительной очистки белка и его диализа против летучего буфера. Кроме того, обработка исходного материала буфером с низкой ионной силой позволяет избежать диализа приготовляемой белковой смеси и использовать супернатант гомогената сразу в аффинной хроматографии.

Для достижения цели изобретения выбраны и обоснованы параметрические значения способа. Так, при обработке ткани плаценты объемом буфера более чем двукратным, наблюдалось разведение белковой смеси и меньшая сорбция на аффинном сорбенте; при обработке ткани плаценты объемом буфера менее чем двукратным, ионная сила приготовляемой белковой смеси была более 0,05, что препятствовало наилучшей сорбции искомого белка на лиганде.

Для аффинной хроматографии ППО-2 на иммобилизованной эпсилонаминокапроновой кислоте оптимальным значением рН для наилучшей сорбции белка было рН от 7,7 до 8,7 и молярность трис-НСl буфера 0,02-0,05; при уменьшении минимального значения рН ниже 7,7 наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, при увеличении рН более максимального 8,7, количество сорбируемого белка отвечало оптимальному значению, однако при этом увеличивалась сорбция балластных белков, что приводило к уменьшению чистоты препарата. Изменение молярности трис-НСl буфера более 0,05 приводило к уменьшению сорбции белка на сорбенте и снижению выхода целевого продукта; при молярности менее 0,02 наблюдалась дополнительная сорбция балластных белков и соответствующее этому уменьшению чистоты препарата.

Существо предполагаемого изобретения поясняют следующие примеры.

П р и м е р 1. 100 г ткани 10-12 недельной плаценты овцы (котиледон) гомогенизируют с 200 мл 0,01 М трис-НСl буфера рН 7,7, гомогенат однократно замораживают, оттаивают и центрифугируют при 6000 об/мин 45 мин. Супернатант используют в аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованной эпсилон-аминокапроновой кислотой, уравновешенной 0,02 М трис-НСl буфером рН 7,7. Связавшиеся белки элюируют 2,0 М раствором хлорида калия, элюат осаждают при 90% насыщении сульфатом аммония, центрифугируют при 8000 об/мин. 45 мин, осадок растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды и фракционируют на колонке с сефадексом G-200, уравновешенной 0,1 М аммоний-бикарбонатным буфером рН 8,15, фракции, содержащие ППО-2, собирают и лиофилизируют, получая 0,05 мг белка. Содержание ППО-2 50% , выход 6,3% .

П р и м е р 2. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,05 М трис-НСl буфере при рН 8,7. Связавшиеся белки элюируют 4,0 М хлоридом калия. Дальнейшие процедуры осуществляют как в примере 1. Получают 0,09 мг белка. Содержание ППО-2 - 30% , выход - 6,8% .

П р и м е р 3. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,035 М трис-НСl буфере при рН 8,2. Элюцию и дальнейшие процедуры осуществляют как в примере 1. Получают 0,08 мг белка. Содержание ППО 2 50% , выход 10% .

Предлагаемый способ является оригинальным способом выделения нового белка - плацентарного протеина овцы-2.

При изучении физико-химических свойств ППО-2 установлено, что данный белок обладает электрофоретической подвижностью (относительно альбумина) - 0,9, молекулярной массой, определенной в гельфильтрации около 70 кД. Белок содержит углеводы при окрашивании дуги преципитации по методу Шиффа и осаждается сульфатом аммония при 35-70% -ном насыщении.

Данные иммунохимического анализа и физико-химические свойства ППО-2 позволяют считать, что этот белок неидентичен альфа-фетопротеину овцы, имеющему сходные с ППО-2 физико-химические характеристики, но встречающемуся в больших количествах в эмбриональной сыворотке; ППО-2 отличается и от плацентарного лактогена овцы, имеющего молекулярную массу около 20 кД и подвижность альфа-глобулина; от овечьего трофобластического протеина, имеющего молекулярную массу 19 кД; от высокомолекулярного гликопротеина овцы, имеющего мол. м. 765 кД.

Разработка оригинального способа выделения ППО-2 и получение к нему антисыворотки является актуальной научной задачей, поскольку данный белок выявлен в ткани ранней плаценты и разработка высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППО-2 в сыворотке крови суягных овец на основе очищенного препарата данного белка позволит получить диагностический тест для ранней диагностики гестации и ее мониторинга. (56) ЕР N 0226181, кл. С 07 К 13/00, 1987.

Использование: сельскохозяйственная биотехнология, экспериментальная ветеринария. Сущность применения: проводят фракционирование супернатанта гомогената ранней плаценты овцы на иммобилизованной через трихлотриазин эпсилон-аминокапроновой кислоте с последующей гель-фильтрацией на сефадексе G-200.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА, включающий получение гомогената ткани, центрифугирование, хроматографирование, элюирование связанного с сорбентом белка, осаждение элюата и повторное центрифугирование, отличающийся тем, что из тканей используют ткань плаценты овцы, из хроматографий используют аффинную хроматографию на сефарозе с иммобилизованной эпсилон-аминокапроновой кислотой, элюирование белка осуществляют 2,0 - 4,0 М раствором хлорида калия, осаждают элюат при 90% -ном насыщении сульфатом аммония, а после центрифугирования осадок дополнительно подвергают фракционированию на сефадексе G = 200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере с последующим сбором фракций, содержащих целевой продукт, и их диализом.