Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов G (lgG) человека, разработки иммунодиагностических препаратов в биологии и медицине.
Известны штаммы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА), взаимодействующие с lgG1, 2, 3, 4 человека, а также с их Fab-, Fc- [4] и только Fc-фрагментами [1] . Отличительным свойством предложенного штамма является продукция антител, взаимодействующих с целыми молекулами lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 человека в шарнирной области и не вступающих в реакцию с Fab-, Fc-фрагментами lgG.
Для гибридомного слияния ранее [4, 1] использовались клетки миеломной линии NS1, которые в отличие от используемой в изобретении линии Sp 2/0 Ag14 синтезируют легкие цепи иммуноглобулинов, способные встраиваться в молекулы антител [2] , что может приводить к инактивации части антител [3] и соответственно снижать эффективность применения для иммуноферментного анализа.
Известно, что каждая вновь полученная гибридома обладает строго индивидуальными параметрами. МКА, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности, способности связывать комплемент, цитотоксичности, гемагглютинирующим и многим другим свойствам. Использование нескольких МКА к иммуноглобулинам в комплексе расширяет возможности применения их в биохимических, иммунологических и клинических исследованиях. Поэтому получение МКА к разным антигенным детерминантам иммуноглобулинов человека, являющимся центральным звеном гуморального иммунитета, позволяет использовать их в различных вариантах иммуноло- гических методов.
Технический результат изобретения заключается в получении гибридного штамма культивируемых клеток Mus musculus L. , продуцирующего МКА к антигенной детерминанте, расположенной в шарнирной области lgG человека.
Штамм получают следующим образом.
Мышей линии BALB/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг lgG (выделенного из сыворотки крови больного аденокарциномой желудка методами переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе) в 0,005 М фосфатном буферном растворе с 0,15 М NaCl, pH 7,4 (PBS) с полным адъювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 4 недели без адъюванта. Через 4 недели после второй иммунизации мышей бустируют путем внутривенного введения 100 мкг lgG в PBS. Через 3 дня у животных определяют титр антител к lgG человека методом иммуноферментного анализа. Мышь с лучшим иммунным ответом используют для получения гибридомы. Для этого 108 клеток селезенки иммунной мыши гибридизируют с 4 х 107 клеток миеломы Sp 2/0 Ag14 в присутствии 50% раствора полиэтиленгликоля с мол. м. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 105 клеток на лунку. В качестве питающего слоя используют перитонеальные макрофаги мыши, которые высевают по 104 клеток на лунку за сутки до гибридизации. Гибридому клонируют два раза методом лимитирующего разведения (из расчета 32 клетки на 96-луночный планшет), высевая клетки на слой перитонеальных макрофагов. После второго клонирования более 90% полученных субклонов продуцируют антитела к lgG человека. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают Н11G5.
Штамм Н11G5 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Тип роста штамма - суспензионный, клетки округлой формы, расположены кластерами. Гибридома вызывает образование смешанных асцитных и солидных опухолей при прививке в перитонеальную полость мышей линии BALB/с в дозе 1 млн. клеток на мышь.
Культуральные признаки. Гибридому культивируют в пластиковых флаконах на 50-250 мл. Посевная доза 5 х 105 клеток на 1 мл. Кратность рассева 1: 5, время субкультивирования 3-4 дня. Среда для культивирования - RPM1-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, по 2 мМ/л глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. В первые 3 недели после гибридизации в среду добавляют 10-4 М гипоксантина, 4 х 10-7 М аминоптерина и 1,6 х 10-5 М тимидина, так как клетки миеломы Sp 2/0 Ag14 дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе. Клетки выращивают в атмосфере 5% СО2 при 37оС.
Культивирование в организме животного. Наработку МКА проводят культивированием клеток "in vivo" на мышах линии BALB/с (предварительно обработанных внутрибрюшинно тетраметилпентадеканом по 0,5 мл) в количестве 1-2 млн. клеток на мышь. Опухоли образуются через 10-14 дней после прививки.
Характеристика полезного продукта. МКА, продуцируемые штаммом Н11G5, относятся к lgG2а подклассу, специфически взаимодействуют с lgG человека в шарнирной области. Принадлежность к подклассу lgG определяют при помощи преципитирующих сывороток против lgG мыши разных подклассов (Sigma, США) методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Взаимодействие антител с lgG человека определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа.
Продуктивность штамма, стабильность продукции антител. Концентрация МКА через 3-4 дня культивирования "in vitro" составляет 5-10 мкг/мл, в асцитной жидкости - 5 мг/мл. Контроль продуктивности осуществляется с помощью иммуноферментного анализа, титр 1/5000. Продуктивность антител сохраняется в течение 25 пассажей в культуре и 15 пассажей на животных.
Контроль контаминации. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК.
Способ криоконсервирования. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: сутки при -70оС, затем ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37оС. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70-80% по окрашиванию трипановым синим.
П р и м е р. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см2 по 5 х 105 клеток в 5 мл среды RPМ1-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, по 2 мМ/л глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Клетки культивируют 3-4 дня при 37оС в атмосфере, содержащей 5% CO2. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Супернатант, содержащий МКА к lgG человека, применяют в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов используют различные иммуноглобулины, выделенные из сыворотки крови здоровых людей и больных миеломной болезнью (методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе): lgG дон, lgG1 Куз, lgG1 Мис, lgG1 Рощ, lgG2 Боб, lgG2 Рыб, lgG2 б/н, lgG3 Дал, lgG4 Жел, lgG4 Бер, lgA, а также lgM (выделенный из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема переосаждением бидистиллированной водой с последующей гель-фильтрацией) и пипаиновые Fab-, Fc-фрагменты lgG человека. Антигены разводят до концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М Na-карбонатном буфере, рН 9,2 и вносят по 50 мкл в лунку 96-луночных планшетов. Инкубируют в течение 1 ч при 37оС, затем сливают и вносят по 100 мкл в лунку 1% -ный раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч при 37оС. После окончания инкубации раствор BSA сливают, планшет промывают холодной водой и PBS с 0,05% твином (ПBST), вносят супернатант культуральной среды по 50 мкл в лунку и инкубируют при 37оС. Через 1 ч содержимое лунок сливают, лунки промывают холодной водой и PBST, добавляют по 50 мкл конъюгата кроличьих антител к lgG мыши с пероксидазой в разведении 1: 500 в растворе PBST и инкубируют при 37оС 1 ч. После тщательного промывания в лунки вносят 0,4 мМ раствор субстрата - 2,2I-азино-ди-[3-этил- бензтиазолинсульфонат(6)] (ABTS) в 0,05 М Na-цитратном буфере, рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01% и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем оценивают результат на спектрофотометре "Multiskan" (Flow, Великобритания) при длине волны 405 нм.
Полученные данные, выраженные в процентах от максимальной экстинкции (1,0-100% ), представлены в таблице.
Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что гибридома Н11G5 продуцируют МКА, специфически взаимодействующие с антигенной детерминантой lgG человека, расположенной в шарнирной области. (56) 1. Lowe J. , Bird P. , Hardie P. et al. // J. Immunol - 1982, v. 47(r). - p. 221-396.
2. Milstein C. , Aletugbo K. , Cowan N. J. et al. // Cold Spring Harbor Symp. Quabt Biol. -1976. -v. 41, p. 793.
3. Kohler O. , Howe S. C. , Milstein C. // Eur. J. Immunol. -1976. -v. 6. -p. 292.
4. Европейский патент N 0163141, кл. C 12 P 21/00, 1985.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения иммунодиагностических и иммунотерапевтических препаратов в биологии и медицине. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к I gG человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных препаратом I gG, с клетками миеломы Sp 2/0 Ag 14. Моноклональные антитела относятся к изотипу I gG 2 а, они специфически связывают целые молекулы I gG человека, но не их Fab- и Fc-фрагменты. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 5 - 10 мкг/мл, в асцитной - 5 мг/мл. 1 табл.
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) N 491 D, используемый для получения моноклональных антител к IgG человека.
