ПОЛИПЕПТИД Е 206, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ВТОРОГО ТИПА, ФРАГМЕНТ ДНК НЕ 206, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД Е 206, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РНЕ 206, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД Е 206, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА Е 206 Российский патент 1995 года по МПК C12N15/48 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и представляет собой гибридный полипептид, состоящий из полипептида, продукта гена env вируса иммунодефицита человека 2-го типа (ВИЧ-2) и β-галактозидазы E. coli, синтезируемый бактериальным штаммом E.coli, несущим рекомбинантную плазмиду, имеющую в своем составе клонированный фрагмент гена env ВИЧ-2 (env2) и связывающийся с антителами к продуктам гена env2, что позволяет проводить серодиагностику синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

СПИД возникает в результате заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ при попадании в организм поражает клетки иммунной системы (Т-лимфоциты, моноциты и макрофаги) и клетки центральной нервной системы. Заболевание характеризуется длительным (от 2-х до 10-и лет) бессимптомным периодом, в течение которого в крови инфицированного определяются только антитела к вирусным белкам, затем следует прогрессирующая деградация иммунной и центральной нервной системы. Поэтому для проведения экстренных противоэпидемических, профилактических мероприятий и своевременного начала лечения ВИЧ-инфекции крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять инфицированных ВИЧ на ранних этапах инфекции.

Многочисленные исследования ВИЧ позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. В настоящее время известно два типа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), имеющих сходную организацию генома и различающихся по антигенной структуре вирусных белков.

ВИЧ имеет наиболее сложное из всех известных ретровирусов строение генома. Помимо генов gag, pol и env, направляющих синтез основных вирионных белков и общих для всех ретровирусов, геном ВИЧ-1 содержит еще шесть генов: vif, tat, rev (или art, или trs), 3'-nef, vpr и vpu. Геном ВИЧ-2, в отличие от ВИЧ-1, не содержит гена vpu, но содержит ген vpx.

Ген env ВИЧ-2 кодирует два гликопротеина с мол.м. 110 и 32 кД, gp110 и gp32, соответственно. Известно, что почти у 100% людей, зараженных ВИЧ-2, можно обнаружить антитела к гликопротеину gp32. Кроме того, у целого ряда ВИЧ-инфицированных обнаруживаются антитела на С-концевой участок гликопротеина gp110.

Большинство методов диагностики ВИЧ-инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в сыворотках крови и других биологических жидкостях (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяется принцип иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлюоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антитело-связывающего субъекта рекомбинантных белков ВИЧ, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты ВИЧ, вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков продуктов генов ВИЧ, в частности гена env.

В настоящее время ведется поиск полипептидов, наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики СПИД. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток продуцентов, так и в направлении выбора наиболее антигеноактивных детерминант и создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов ВИЧ.

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный гибридный полипептид Е206, состоящий из полипептида продукта фрагмента генома ВИЧ-2, слитного с β-галактозидазой E.coli, связывающий антитела к продукту гена env ВИЧ-2; фрагмент ДНК, кодирующий полипептид Е206 и входящий в состав рекомбинантной плазмиды рНЕ206; штамм E.coli ВКПМ N В-5872, содержащий рекомбинантную плазмиду рНЕ206 и экспрессирующий белок Е206.

Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемые для культивирования Escherichia coli и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37^оС колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30-32^оС колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре 4-37^оС при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические вещества в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага λ проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30-32^оС. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39-42^оС. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага λ составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 5 х 10⁸ кл/мл. Белок стабилен при температуре 4^оС в течение 3-4 мес.

Рекомбинантный полипептид Е206, выделенный и очищенный из штамма продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к продуктам гена env ВИЧ-2 в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики промышленных микроорганизмов г. Москва под N В-5872.

П р и м е р 1. Получение фрагмента ДНК НЕ206.

У ВИЧ-инфицированного человека отбираются из вены 10 мл гепаринизированной крови, к которой добавляют 30 мл лизирующего раствора (155 мМ NH₄Cl; 10 мМ KHCO₃; 0,1 мМ EDTA). Смесь инкубируют 15 мин на льду. Центрифугируют при 2000 G 10 мин при 4^оС. Белые клетки ресуспендируют в 10 мл SE (75 мМ NaCl, 2 мМ EDTA) добавляют протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и 1 мл 20% SDS. Смесь инкубируют 4 ч при 37^оС, добавляют 1/2 объема (5 мл) водонасыщенного фенола и такое же количество хлороформа с изоамиловым спиртом (24: 1). Полученную смесь встряхивают на качалке 15 мин и центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин. К отобранной водной фазе добавляют 1/30 объема NaOAc (рН 5,5) и равный объем изопропилового спирта. ДНК осаждают центрифугированием и промывают 70%-ным раствором этилового спирта. Осадок ДНК растворяют в буфере ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,0) до конечной концентрации 1 мкг/мл.

В эппендорфовскую пробирку на 0,5 мл вносят следующие компоненты: деионизированная вода 43,5 мкл, реакционный буфер 10 мкл х 10 (конечная концентрация 25 мМ Трис-HCl, рН 8,3 (при 25^оС), 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 1 мМ β-меркаптоэтанол, желатин 200 мкг/мл), смесь dNTP 16 мкл (конечная концентрация 200 мкМ), праймер N1 5-CTGCACTAAAGGATCCGTCC-3' 10 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ), праймер N2 5'-CTGCAGGCTTCAGTAGTGT-3' 10 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ), ДНК (матрица для амплификации) 10 мкл (конечная концентрация 1 нг), Taq полимеразу 0,5 мкл (2,5 единицы на пробу).

Содержимое пробирки перемешивают на вортексе 3-4 с и осаждают на микроцентрифуге в течение 5-10 с.

В пробирку добавляют 50 мкл минерального масла и помещают в аппарат для амплификации ДНК N 801-0177 DNA Thermal Cycler Perkin-Elmer Corporation.

Реакционную смесь инкубируют при 94^оС 7 мин, а затем проводят цикл амплификации со следующими параметрами: 2 мин при 37^оС (гибридизация праймеров), 5 мин при 72^оС (достройка праймеров), 2 мин при 94^оС (денатурация ДНК). Цикл амплификации повторяют 25 раз. После последнего цикла амплификации реакционную смесь инкубируют при 72^оС 10 мин.

В пробирку вносят 50 мкл хлороформа, материал с хлороформом встряхивают 5 с на вортексе, а затем центрифугируют на микроцентрифуге 10 с. Отбирают водную (верхнюю) фазу (около 100 мкл), которая образуется в форме сферической капли, и переносят в чистую пробирку.

10 мкл водной фазы используют для анализа продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием (виден фрагмент 430 п.н.).

Методом Сэнгера определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК НЕ206.

ACGGATCCTTTAGTGCAGAGGTGGCAGAACTATACCGATTGGAATTGGGGGATTATAAAT
TAGTAGAAGTAACACCAATTGGCTTCGCACCTACAGCAGAAAAAAGATACTCCTCTGCTC
CAGGGAGACATAAGAGAGGTGTGCCTGTGCTAGGGTTCCTAGGTTTTCTCACGACAGCAG
GTGCTGCAATGGGCGCGGCGTCTCTGACGCTATCGGCTCAGTCTCGGACTTTATTGGCTG
GGATAGTGCAGCAACAGCAACAGCTGTTGGACGTGGTCAAGAGACAACAAGAAATGTTGC
GACTGACCGTCTGGGGAACTAAAAACCTCCAGGCAAGAGTCACTGCTATCGAGAАGTACC
TAGCAGACCAGGCACGACTAAATTCATGGGGATGTGCGTTTAGACAAGTCTGCCACACTA
CTGAAGCCTGCAG
П р и м е р 2. Получение плазмиды pHE206.

Синтезированный на ДНК-матрице фрагмент ДНК гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI в буфере для рестрикции (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl и 1 мМ дитиотрейтол рН 7,5) в течение 14 ч при температуре 37^оС. Ферменты инактивируются нагреванием при 70^оС 15 мин. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл H₂O. 10 мкл обработанного рестриктазами фрагмента ДНК помещают в эппендорфовскую пробирку, содержащую 3 мкл лигазного буфера (50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl₂, 20 мМ дитиотрейтол, 1,0 мМ АТФ, 50 мкг/мл бычий сывороточный альбумин), 2 мкл (0,2 мкг/мл) ДНК векторной плазмиды pEL5А, обработанной рестриктазами PstI и BamHI, 4 мкл H₂O. К смеси добавляют 1 мкл (100 ед) Т4 ДНК лигазы и смесь инкубируют 3 ч при 16^оС.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E. coli штамм PLT90 по обычной методике. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1%-ным LB-агаром, содержащие 25 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами PstI и BamHI и гидролизат исследуют электрофорезом в 1%-ном агарозе.

Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма НЕ206 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 430 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК. При определении нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК установлено, что синтезированный нами фрагмент ДНК в плазмиде pНЕ206 через BamHI сайт присоединен к С-концевому участку β-галактозидазы E. coli.

П р и м е р 3. Штамм E. coli НЕ206, содержащий плазмиду pНЕ206, выращивают в 100 мл среды LB при 30^оС до плотности 8 х 10⁸ кл/мл. После этого температуру повышают до 37^оС и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу.

Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли. В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс 20-160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E. coli PLТ90, содержащий векторную плазмиду pEL5А и не содержащий полученную нами плазмиду pHE206. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E. coli НЕ206, содержащий плазмиду pНЕ206, экспрессирует гибридный полипептид мол. м. 130-135 кД. Этот полипептид назван Е206. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида (последовательность β-галактозидазы не представлена), определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента провирусной ДНК ВИЧ-2 представлена ниже:
G S F A E V A E L Y R L E L G D Y K L V E V T P I
G F A P T A E K R Y S S A P G R H K R G V P V L G F
L G F L T T A G A A M G A A S L T L S A Q S R T L L
A G I V Q Q Q Q Q L L D V V K R Q Q E M L R L T V W
G T K N L Q A R V T A I E K Y L A D Q A R L N S W G
C A F R Q V C H T T
П р и м е р 4. Контроль антигенной активности.

Контроль антигенной активности препаратов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны BH85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24 В, 400 мА в течение 1 ч. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной TXУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15 М NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленном на 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. После блокирования температуры в течение 1 ч при 37^оС обрабатывают сывороткой, содержащей антитела к вирусу ВИЧ-2, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37^оС в течение часа. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1 М трис-HCl, рН 8,0). Анализ показывает, что полипептид Е206 связывается с антителами к вирусу иммунодефицита человека второго типа.

Таким образом, данное изобретение позволяет определять антитела к продуктам гена env ВИЧ-2 с высокой эффективностью и специфичностью, а сам процесс определения не требует работы с высокоинфекционным вирусным материалом.

Использование: в биотехнологии, генной инженерии и иммунологии. Сущность изобретения заключается в том, что создан гибридный полипептид Е206, состоящий из полипептида продукта гена env ВИЧ-2 и β -галактозидазы E. coli. Гибридный полипептид синтезируется бактериальным штаммом Escherichia coli ВКПМ N В-5872. Штамм получен в результате трансформации плазмидной ДНК pHE206, несущей фрагмент гена env ВИЧ-2. 4 с.п. ф-лы.

1. Полипептид Е 206, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека второго типа, полученный в штамме бактерий Escherichia coli ВКПМ NB-5872, трансформированном рекомбинантной плазмидой pHE 206, кодирующей полипептид со следующей аминокислотной последовательностью, приведенной в описании, слитой с β -галатозидазой E. coli и обладающий способностью связываться с антителами к продукту гена env ВИЧ-2, с мол.м. 130 135 килодальтон при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле. 2. Фрагмент ДНК НЕ 206, кодирующий полипептид Е 206, полученный с помощью цепной реакции полимеризации, с нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании, содержащий на 3′-конце стоп-кодон. 3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHE 206, кодирующая полипептид Е 206, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека второго типа, размером 6830 п.о. содержащая Bam HI -PstI фрагмент ДНК вектора P EL 5А, включающий ген β-галактозидазы E. coli, размером 6400 п.о. Bam HI Pst I фрагмнт ДНК НЕ 206, кодирующий полипептид Е 206, размером 430 п.о. по одному участку расщепления рестриктазами Bam HI, Sma I, SalGI, Pst I; промотор бактериофага лямбда croLac Z; генетические маркеры: ген Amp² ген устойчивости к ампициллину. 4. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ NB-5872 продуцент полипептида Е 206, предназначенного для определения антител к вирусу иммунодефицита человека второго типа.