СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТОКСИКАЦИИ ОРГАНИЗМА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине (разделу хирургии) и может быть использовано для определения уровня токсичности организма, что необходимо для выбора тактики лечения.

Известны различные способы (плазмафорез, плазмасорбция), которые используются как методы детоксикации у больных с различной патологией.

Однако для выбора способа детоксикации необходимо определять степень интоксикации организма больного. В настоящее время не существует способа высокоспецифичного, чувствительного, который можно было бы использовать для быстрого анализа уровня токсичности организма.

Вышеизложенное диктует необходимость поиска и разработки способа, с помощью которого можно:
проводить достоверную оценку токсичности сыворотки крови и обосновывать показания к проведению плазмафореза с учетом клинической симптоматики;
контролировать в динамике уровень токсичности сыворотки крови у больных как во время пребывания больного в стационаре, так и в условиях поликлиники.

Известен способ определения степени интоксикации организма, заключающийся в исследовании уровня "средних молекул"-СМ в сыворотке крови (Шиманко А. И. "Комплексная детоксикация и коррекция гомеостаза у больных с хронической и острой артериальной недостаточностью нижних конечностей". М. , Автореферат докт. дисс. , 1990, с. 11-14. ).

Однако этот способ не позволяет регистрировать общую эндотоксичность сыворотки (способ позволяет определять токсичность, связанную только с веществами пептидной природы).

Кроме того, известен способ определения токсичности сыворотки крови с помощью парамецийного теста. Способ заключается в том, что для оценки токсичности используют парамеции, которые под действием токсических веществ, находящихся в сыворотке крови, погибают. С этой целью парамеции инкубируют в присутствии сыворотки крови больного и донора в течение суток при 25^оС. После инкубации подсчитывают число оставшихся в живых парамеций. По разнице между числом парамеций у донора и больного судят о величине токсичности крови. Если разница между числом парамеций у донора и больного будет меньше 40% , считают, что сыворотка крови больного в этом случае не токсична, если эта разница 40% и выше, говорят о токсичности сыворотки больного.

Недостатком способа является низкая чувствительность и длительность проведения анализа (более 2 сут), что очень неудобно для больных с острыми воспалительными заболеваниями органов желудочно-кишечного тракта (о. панкреатит, перитонит и др. ).

Целью изобретения является повышение эффективности оценки токсичности сыворотки крови за счет сокращения сроков проведения исследования, повышения чувствительности и специфичности, а также упрощения способа.

Цель достигается тем, что в предлагаемом способе определения степени интоксикации организма используют сыворотку крови больных, освобожденную от гемагглютининов, и тестируемую систему - эритроцитарную массу крыс, обогащенную ретикулоцитами за счет предварительного кровопускания. Способ выполняется по следующей схеме: у больных берут по 2-3 мл крови, выдерживают по 0,5 ч при комнатной температуре, центрифугируют, получают сыворотку крови больного, освобождают ее от гемагглютининов путем смешивания с эритроцитами интактных крыс в отношении 3: 1, снова центрифугируют, собирают сыворотку крови, хранят при Т = (- 18^оС) до использования, по мере необходимости берут 0,1 мл сыворотки, вносят ее в инсулиновый флакончик, добавляют туда равное количество физ. р-ра и эритроцитарной массы, полученной от крыс с острой кровопотерей, взвесь перемешивают и инкубируют при 37^оС в присутствии антибиотиков в течение 20 ч, готовят мазки, окрашивают бриллианткрезилблау, подсчитывают ретикулоциты. По величине ретикулоцитов (Р_О) судят о токсичности сыворотки, которая тем выше, чем больше число заблокированных в процессе дифференцировки ретикулоцитов. Импирически установлено, что число ретикулоцитов, равное 40% _о и ниже, соответствует контрольным значениям.

В том случае, когда число ретикулоцитов становится более 40% _о, наблюдается появление токсических (ингибирующих) факторов в испытуемой сыворотке. Их уровень тем выше в сыворотке, чем больше число заблокированных ретикулоцитов (Р_о).

Способ оценки токсичности сыворотки крови осуществляют следующим образом. У больного берут из локтевой вены по 2-3 мл крови в центрифужные пробирки, отстаивают ее 20-30 мин, центрифугируют свернувшуюся кровь при 1500 об/мин 20-30 мин, собирают надосадочную жидкость (сыворотку крови) в новые центрифужные пробирки, освобождают сыворотку от гемагглютининов путем смешивания их в отношении (3: 1) с эритроцитами крыс, заготовленных заранее и трижды отмытых физиологическим раствором. Снова центрифугируют сыворотку в тех же условиях, отделяют ее от эритроцитарной массы и хранят в морозилке до использования (Т = -= 18^оС). Для обнаружения в полученной сыворотке токсических (ингибирующих) факторов используют культуру клеток периферической крови крыс, обогащенных активированными ретикулоцитами.

С этой целью за неделю до проведения опытов с культурой клеток у крыс предварительно вызывают острую кровопотерю из бедренной артерии в объеме 1,5-2% от массы тела. Это вызывает 20-40-кратное увеличение числа ретикулоцитов в периферической крови. Для получения таких активированных ретикулоцитов у крыс забирают кровь в центрифужные пробирки с физиологическим раствором и 20-50 ЕД гепарина, кровь центрифугируют, надосадочную жидкость отбрасывают, а эритроцитарную массу, обогащенную ретикулоцитами, распределяют в инкубационные инсулиновые флакончики по 0,1 мл. Во флакончики добавляют по 0,1 мл физиологического раствора и тестируемой сыворотки крови, освобожденной от гемагглютининов, и инкубируют смесь в присутствии антибиотиков (пенициллин 50 ЕД/мл, стрептомицин 50 мкг/мл при 37^оС в течение 20 ч. После окончания инкубации готовят мазки из взвеси эритроцитов, окрашивают их бриллианткрезилблау, подсчитывают число ретикулоцитов среди 500-1000 проанализированных эритроцитов в мазках (Р_о) и выражают результаты в промилле. По Р_о судят о величине токсичности сыворотки крови, и делают вывод об интоксикации организма при значении Р_о выше 40% о.

П р и м е р 1. Больной, Чайковский С. А. 63 лет, N истории болезни 18663, поступил в хирургическое отделение 81 больницы г. Москвы 28.09.89 г. с диагнозом: Диабетическая ангиопатия, ишемия IV степени, гангрена 1-го пальца правой ноги. Для определения степени интоксикации организма у данного больного взяли 2 мл крови из локтевой вены, поместили в центрифужную пробирку, затем дали крови отстояться 20 мин, после чего свернувшуюся кровь центрифугировали 20 мин при 1500 об/мин. После центрифугирования сыворотку крови собрали в центрифужную пробирку, в которую добавили эритроциты крысы в отношении 3: 1 с целью освобождения сыворотки больного от гемагглютининов. Снова центрифугировали сыворотку в тех же условиях, отделяли ее от эритроцитарной массы и использовали ее для определения степени интоксикации организма по ретикулоцитарному тесту. Затем брали кровь у крысы, которую предварительно за 7 сут до постановки ретикулоцитарного теста кровопускали из бедренной артерии в объеме 1,5-2% от массы тела. Для получения активированных ретикулоцитов, у крыс забирали кровь в центрифужные пробирки с физиологическим раствором и 20-50 ЕД гепарина в 1 мл физиологического раствора, кровь центрифугировали, надосадочную жидкость отбрасывали, а эритроцитарную массу, обогащенную ретикулоцитами, распределяли в инкубационные инсулиновые флакончики по 0,1 мл.

Во флакончики добавляли по 0,1 мл физиологического раствора. Затем сыворотку больного, освобожденную от гемагглютининов в объеме 0,1 мл, помещали в инсулиновый флакончик, содержащий эритроцитарную массу крыс и 0,1 мл физиологического раствора. Полученную смесь инкубировали в присутствии антибиотиков (пенициллин 50 ЕД/мл, стрептомицин 50 мкг/мл) при 37^оС в течение 20 ч. После окончания инкубации готовили мазки из взвеси эритроцитов, окрашивали их бриллианткрезилблау, подсчитывали число ретикулоцитов среди 500 проанализированных эритроцитов в мазках и выражали результаты в промилле. Степень интоксикации организма по ретикулоцитарному тесту у данного больного составила 298% _о. Больному назначен плазмафорез в объеме 1,6 л. Через сутки после проведения плазмафореза у больного вновь взяли 2 мл крови из локтевой вены, центрифугировали, получали сыворотку и по той же методике определяли степень интоксикации организма, которая составила 130% _о. Снижение эндотоксичности сопровождалось клиническим улучшением состояния больного. Больной выписан 24.10.89 г. в удовлетворительном состоянии.

П р и м е р 2. Больная, Борисова Т. Г. , 67 лет, N истории болезни 4357162 поступила в хирургическое отделение 81 больницы г. Москвы 1.03.90 г. с диагнозом: Диабетическая макроангиопатия, ишемия III степени левой нижней конечности. Для определения степени интоксикации организма у данной больной взяли 2 мл крови из локтевой вены, поместили в центрифужную пробирку, крови дали отстояться 20 мин, свернувшуюся кровь центрифугировали 20 мин при 1500 об/мин. После центрифугирования сыворотку крови собрали в центрифужную пробирку, в которую добавили эритроциты крысы в отношении 3: 1 с целью освобождения сыворотки больной от гемагглютининов. Снова центрифугировали сыворотку в тех же условиях, отделяли ее от эритроцитарной массы и использовали для определения степени интоксикации организма по ретикулоцитарному тесту. Параллельно брали кровь у крысы, которую предварительно за 7 сут до постановки ретикулоцитарного теста кровопускали из бедренной артерии в объеме 1,5-2% от массы тела. Для получения активированных ретикулоцитов у крыс забирали кровь в центрифужные пробирки с физиологическим раствором и 20-50 ЕД гепарина в 1 мл физиологического раствора, кровь центрифугировали, надосадочную жидкость отбрасывали, а эритроцитарную массу, обогащенную ретикулоцитами, распределяли в инкубационные инсулиновые флакончики по 0,1 мл.

Во флакончики добавляли по 0,1 мл физиологического раствора. Затем сыворотку больной, освобожденную от гемагглютининов в объеме 0,1 мл, помещали в инсулиновый флакончик, содержащий эритроцитарную массу крыс и 0,1 мл физиологического раствора. Полученную смесь инкубировали в присутствии антибиотиков (пенициллин 50 ЕД/мл, стрептомицин 50 мкг/мл) при 37^оС в течение 20 ч. После окончания инкубации готовили мазки из взвеси эритроцитов, окрашивали их бриллианткрезилблау, подсчитывали число ретикулоцитов среди 700 проанализированных эритроцитов в мазках и выражали результаты в промилле. Степень интоксикации организма по ретикулоцитарному тесту у данной больной составила 204% _о. Больной назначен плазмафорез в объеме 1,6 л. Через сутки после проведения плазмафореза у больной снова взяли 2 мл крови из локтевой вены, отцентрифугировали ее, получили сыворотку и тем же способом определили степень интоксикации организма.

Через сутки после проведения плазмафореза степень интоксикации организма составила 72% _о. Снижение эндотоксичности сопровождалось значительным улучшением клинического состояния больной. Больная выписана из больницы 14.04.90 г. в удовлетворительном состоянии.

Всего проведено 56 определений степени интоксикации организма у 13 больных сахарным диабетом с критическими степенями ишемии нижних конечностей до лечения и после лечения плазмафорезом в динамике лечения (1 ч, 2 ч), 1 сутки, 7 сутки, 14 сутки) и 11 определений степени интоксикации организма у доноров.

Результаты исследований приведены в таблице.

Совокупность изложенных выше данных, позволяет охарактеризовать ретикулоцитарный тест оценки токсичности сыворотки крови как высоко чувствительный. В пользу этого свидетельствует высокая степень достоверности различий между количеством ретикулоцитов у больных и доноров (Р < 0,001). Высокая чувствительность способа позволяет обнаружить степень интоксикации организма в динамике лечения.

По сравнению с парамецийным тестом ретикулоцитарный тест более высоко специфичен, это связано с тем, что для постановки ретикулоцитарного теста в качестве тест-системы используют клетки крови теплокровных животных, которые по чувствительности близки к клеткам крови человека, тогда как для постановки парамецийного теста используются простейшие-парамеции. Ретикулоцитарный тест по сравнению с парамецийным легко воспроизводим, требует меньшей затраты времени, что важно в условиях клиники. (56) Роскин Г. И. Методика и достоверность определения цитотоксического эффекта сыворотки раковых больных. Бюл. экспер. биол. и мед. 1944, т. 18, вып. 3, N 9, с. 9-12.

Использование: в медицине, а именно хирургии, и может применяться для определения уровня токсичности организма, что необходимо для выбора тактики лечения. Целью изобретения является повышение эффективности оценки токсичности сыворотки крови за счет сокращения сроков проведения исследования, повышения чувствительности и специфичности, а также упрощения способа. Сущность изобретения: сыворотку крови больных, освобожденную от гемагглютининов, и тестируемую систему - эритроцитарную массу крыс, обогащенную ретикулоцитами за счет предварительного кровопускания, смешивают, полученную смесь инкубируют, готовят мазки из взвеси эритроцитов, окрашивают их и подсчитывают число ретикулоцитов (P_o) в промиллях и делают вывод об интоксикации организма при значении P_o выше 40% . Данный способ является высокочувствительным, специфичным, легковоспроизводимым, требует меньшей затраты времени, поэтому его можно применять не только в клинических условиях, но и в амбулаторных. 1 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТОКСИКАЦИИ ОРГАНИЗМА путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что исследуемую сыворотку крови освобождают от гемагглютининов, смешивая ее с эритроцитами интактных крыс в соотношении 3 : 1, после чего центрифугируют смесь и в полученную сыворотку добавляют эритроцитарную массу крыс, обогащенную ретикулоцитами, взятых в соотношении сыворотка: эритроцитарная смесь 1 : 1, инкубируют при 37^oС в присутствии антибиотиков в течение 20 ч, готовят мазки из взвеси эритроцитов, окрашивают их, подсчитывают число ретикулоцитов и при значении показателя 40% и более определяют наличие интоксикации в организме.