Способ определения инсулинорезистентности у больных сахарным диабетом I типа Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области клинической медицины, а именно к лабораторной диагностике инсулинорезистентности у больных сахарным диабетом I типа.

Согласно данным литературы, в патогенезе инсулинорезистентности участвуют аутоантитела к специфическим рецепторам. Ранее выявление этих антитеп обеспечит своевременную профилактику развития ре- зистентности к гормону и соответствующую ее терапию. Однако, методом выявления антител и инсуяинорецепторэм, пригодных для клиники, в доступной медицинской литературе не обнаружено.

Целью изобретения является повышение точности диагностики инсулинорезистентности.

Способ осуществляют следующим образом.

В две центрифужные пробирки (одна - для определения исходного содержания инсулиновых розеток в суспензии лейкоцитов крови донора, другая - для изучения действия на клетки сыворотки крови обследуемого) забирают по 0,1-0:2 мл крови в 0,1-0,2 мл 5% свежеприготовленного раствора цитрата натрия для предупреждения свертывания крови. После тщательного встряхивания содержимого пробирок в него вносят для лизирования эритроцитов по 0,8-0,9 мл дистиллированной воды. Смесь встряхивают 20-30 секунд и добавляют до 10 мл среду 199. Суспензии клеток центрифугируют 5-6 минут при 1500 об/мин, после чего надоса- дочную жидкость отсасывают пипеткой, вновь добавляют 1 мл среды 199 и снова центрифугируют. Отсосав надосадочную жидкость, осадок одной пробирки оставляют временно без воздействий. Осадок втоV|Os

Ю

К

рой пробирки соединяют с 0,1 0,2 мл исследуемой, полученной путем отстаивания крови, декомплементированной сыворотки крови больного, разведенной средой 199 в интервале отношений от 1:10 до 1:20. Смесь осторожно встряхивают и инкубируют при температуре +37°С в течение 30 минут. После инкубации с сывороткой лейкоциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия путем центрифгуирования при 1500 об/мин в течение 5-6 минут, затем надоса- дочную жидкость отсасывают пипеткой, После этого осадки в обеих пробирках ресуспендируют в 0,1 -02 мл изотонического раствора хлорида натрия рН 7.2: К полученным взвесям лейкоцитов добавляют по 0,1-0,2 мл 0.5% вззеси эритроцитарного ди- агностикума, смесь инкубируют при температуре в течение 10 -15-минут, а затем в течение 18 в условиях холодильника (+4° С) Через 18 часов в обе пробирки добавляют 1 мл 50% бычьей сыворотки, смесь центрифугируют при 15000 об/мин 5-6 минут, надосадочную жидкость сливают, а из осадков делают мазки, которые высушивают на воздухе, фиксируют в этиловом спирте 20-25 минут и окрашивают по Романовскому-Гимза. Просматривают под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмечая среди них число (%) лимфоцитов фиксировавших на себе три и более эритроцита.

При наличии в сыворотке крови больного антител к инсулинорецепторам отмечается активация лимфоцитов крови донора с увелмчг ,к -1 среди них числа лимфоцитов, , взаимодействовать с эритроцитами барана, нагруженными инсулином, ч ростом числа мпсулиноиых розеток в 3 и более раз На сновании этих данных ставится диагноз шсулинорезистентности иммунного генезэ

Для приготовления диагностикума используют эритроциты баоана,- обработанные глютаровым альдегидом, Свежие эритроциты барана трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия рН 7,2, центрифугируя взвесь в течение 10 минут при 1500 об/мин. Из отмытых эритроцитов готовяч 5% взвесь, соединяя 0,5 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл забуферзниого изотонического раствора хлорида натрия рН 7,2. Смешивают 5% взвесь эритроцитов с 0.25% свежеприготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1:1, Выдерживают смесь при температуре +37°С Q течение 15 минут, после чего эритроциты тщательно отмывают от глютарового альдегида забуферемным изотоническим раствором хлорида нчтрия и доводят тем же

раствором до первоначального объема (5% взвесь). Приготовленные таким образом эритроциты хранятся при температуре +4°С в течение 6 месяцев.

Для сенсибилизации эритроцитов инсулином глютаризированные эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия рН 6.4 и доводят им же взвесь до первоначального объема. Затем соединяют

0 с раствором инсулина, содержащим 20 Ед/мл, в соотношении 1:1. Смесь оставляют при комнатной температуре на 20 минут, после чего отмывают дважды забуферен- ным раствором натрия рН 7.2. Слив надоса5 дочную жидкость, обьем доводят до первоначального (5% взвесь). В реакции используют 0,5% взвесь сенсибилизированных эритроцитов, которую готовят из исходной (5%) взвеси путем соединения 1 мл ее с 9 мл

0 среды 199.

П р и м е р 1. Больная Л-ва НЕ.. 18 лет, поступила в эндокринологическое отделение ОКБ г.Перми 5 января 1989 года с жалобами на общую слабость, жажду. Больная с

5 декабря 1988 года после перенесенного простудного заболевания. Была тяжелая диабетическая кома. Объективно: пониженного питания, весь 50 кг. Тоны сердца приглушены, АД - 90/60 мм рт.ст., дыхание

0 жесткое. Живот мягкий, печень увеличена и выступает а 1,5 см из-под реберной дуги. Содержание сахара в крови 14,3-23,7-28,6 м/моль/л, в моче - 4-3%, ацетон +. получает 44 ЕД инсулина. Диагноз: сахар5 ный диабет, i тип, тяжеоая форма, лабильное течение, декомпенсированный. Диабетическая эни.-Ьэлоплтия Хронический пиелонефрит. Пнсулинорезистент- ность,

0 При изучении сыворотки крови больной в две центрифужные пробирки забирали по 0.1 мл крови в 0,1 мл 5% спежеприготовлен- ного раствора цитрэта натрия. После встряхивания содержимого пробирок в него

5 вносили по 0,8 мл дистиллированной воды, а затем до 10 мл среду 199. Суспензии клеток центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывали пипеткой, добавляли 1 мл среды и сно0 вэ центрифугировали при том же режиме. 1 - сосав надосадочную жидкость, осадок одной из пробирок соединяли с 0.1 мл исследуемой, декомплементированной, сывороткой крови больного, разведенной

5 средой 199 1:10 или 1:20. Смесь осторожно встряхивали и инкубировали при температуре +37°С в течение 30 минут. После инкубации лейкоциты отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифу- гиросания и отсасывали натосадочную жидкость. Затем осадки в обеих пробирках ре- суспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7,2. К получен- ным взвесям лейкоцитов добавляли по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагно- стикума, и смесь инкубировали при температуре +37°С 10 минут, затем в течение 18 часов в условиях холодильника (+4°С). Через 18 часов в обе пробирки добавляли 1 мл 50% бычьей сыворотки, и смесь центрифу- гировали при 15 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость сливали, а из осадков делали мазки, которые высушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом 20 минут и окрашивали по Романовскому-Гим- за. Просматривали под микроскопом 100 лимфоцитов, отмечая среди них лимфоциты, фиксировавшие на себе три и более эритроцита.

В сыворотке крови больной обнаруже- ны антитела к инсулинорецепторам, так как сыворотка антивировалз лимфоциты крови донора, увеличивая число инсулиновых розеток в 4,5 раза (разведение 1:10) и в 7.5 раза (разведение 1:20). На основе этих дан- ных поставлен диагноз инсулинорезистент- ности имунного генеза.

Пример 2. Больной М-в Г.В., 32 года, поступил в эндокринологическое отделение ОКБ г. Перми 2 ноября 1988 года с жалобами на боли в эпигастральной области, тошноту, рвоту, похудание. Болен с 1984 года. Обострение заболевания началось с 9 октября 1988 года. Объективно: больной истощен (- 15 кг). Сердце и легкие без особенностей. Язык обложен. Живот резко болезненен в зоне проекции поджелудочной железы. Печень резко выступает из-под ребреного края на 5 см. Содержание сахара в крови 15,2-12,9-9,0-14,4-28,4 м/моль/л, в моче - 6-7%. Больной получает 208 ЕД инсулина. Диагноз: Хронический панкреатит, болевой вариант, рецидивирующее течение, обострение. Панкреатический сахарный диабет, декомпенсация. Инсулинорезиг.тентность.

При изучении сыворотки крови больного в две центрифузные пробирки забирали по 0,1 мл крови в 0,1 мл 5% свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После встряхивания содержимого пробирок в него вносили оо 0,8 мл дистиллированной воды, затем до 10 мл среду 199. Суспензии клеток центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывали пипеткой, добавляли 1 мл среды и сно- ва центрифугировали при гом же режиме. Отсосав надосадочную жидкость, осадок одной из пробирок соединяли с 0,1 мл исследуемой, декомплементированной, сывороткой крови больного, разведенной

средой 199 1:10 или 1 20. Смесь осторожно встряхивали и инкубировали при температуре ц37°С в течение 30 мин После инкубации лейкоциты отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования и отсасывали надосадочную жидкость. Затем осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0.1 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7,2. К полученным взвесям лейкоцитов добавляли по 0.1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагности- кума, и смесь инкубировали при температуре +37°С 10 минут, а затем в течение 18 часов в условиях холодильника (+4°С). Через 18 часов в обе пробирки добавляли 1 мл 50% бычьей сыворотки, и смесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отсасывали, а из осадков делали мазки, которые высушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом 20 мин и окрашивали по Романовскому-Гим; за. Просматривали под микроскопом 100 лимфоцитов, отмечая среди них лимфоциты, фиксировавшие на себе три и более эритроцита.

Заключение. При исследовании сыворотки крови больного заявляемым способом обнаружены антитела к инсулинорецепторам, так как сыворотка активировала лимфоциты донора и увеличивала число инсулиновых розеток в 3,7 раза (разведение 1:10) в 5 раз (разведение 1:20). На основе этих данных поставлен диагноз инсулинорезистентно- сти иммунного генеза.

Пример 3. П-в И.И., 30 лет, практически здоровый донор. Объективно нормальное телосложение, вес 64 кг. Язык чистый. Сердечно-сосудистая и дыхательная системы без особенностей. Живот мягкий, безболезненный. Содержание сахара в крови в норме. При исследовании сыворотки крови донора в две центрифужные пробирки забирали по 0,1 мл крови в 0,1 мл 5% свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После встряхивания содержимого пробирок в него сносили по 0,8 мл дистиллированной воды, а затем до 10 мл среду 199. Суспензии клеток центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин, после чего нэдосадочную жидкость отсасывали пипеткой, добавляли 1 л среды и снова центрифугировали при том же режиме. Отсосав надосадочную жидкость, осадок одной из пробирок соединяли с 0,1 мл исследуемой, декомплементированной, сывороткой крови донора, разведенной средой 199 1:10 или 1:20. Смесь осторожно встряхивали и инкубировали при температуре +37°С в течение 30 минут. После инкубации лейкоциты отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования и отсасывали надосадочную жидкость. Затем осадки в обеих пробирках ре- суспендировали в ОД мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7.2. К полученным взвесям лейкоцитов добавляли по 0,1 мл 5% взвеси эритроцитарного диагности- кума, и смесь инкубировали при температуре +37°С 10 минут, затем в течение 18 часов в условиях холодильника (+4°С). Через 18 часов в обе пробирки добавляли 1 мл 50% бычьей сыворотки, и смесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут, Надосадочную жидкость сливали, а из осадков делали мазки, которые высушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом 20 ми- нут и окрашивали по Романовскому-Гимза. Просматривали под микроскопом 100 лимфоцитов, отмечая среди них лимфоциты, фиксировавшие на себе три и более эритроцита.

В результате исследования установлено, что обработка лимфоцитов донора разведенной сывороткой крови здорового человека число инсулиновых розеток практически не изменяла (исходное число 9%, после обработки сывороткой, разведенной 1:10-7%, разведенной 1:20 - 4%). Заключение: антител к инсулинорецепторам в крови донора нет.

Преимущества способа заключаются в его высокой специфичности и чувствительности, технической простоте исполнения и чтения его результатов, малом (0.1-0,2 мл) количестве крови, забираемой у больного из пальца, в необходимости минимальных ко- личество доступных реактивов и несложного оборудования, что позволяет осуществлять проведение способа в условиях клиники (больницы), в отсутствии необходимости привлечения высококвалифицированного персонала для реализации способа. Выяснение генеза неэффективности инсулиноте- рапии, обусловленной разными иммунными факторами (антитела к инсулину, инсулино- рецепторам и т.д.) представляет большой практический интерес, являясь основой для рациональной гормонотерапии, иммуносуп- рессивного и других видов лечения.

Способ дает также возможность раннего выявления энтирецепторных антител в крови больного диабетом, что позволяет диагностировать начало развития инсулиноре- зистентности.

Формула изобретения Способ определения инсулинорези- стентности у больных сахарным диабетом I типа, включающий забор крови и ее исследование, отличающийся тем. что, с целью повышения точности способа, из крови выделяют сыворотку, разводят ее средой 199 в соотношении 1:10-20. инкубируют с лимфоцитами здорового человека при 37°С в течение 30 мин. добавляют эритроциты барана, сенсибилизированные инсулином, подсчитывают количество розеткообраэую щих клеток и при увеличении их количества в 3 и более раз по сравнению с контролем определяют инсулинорезистентность- имун- ного генеза.

Изобретение относится к клинической медицине. Цель изобретения - повышение точности диагностики инсулинорезистент- ности. Для осуществления способа лимфоциты крови донора инкубируют с сывороткой крови больного, разведенной питательной средой в интервале соотношений 1:10 до 1:20, при температуре +37°С в течение 30 мин, добавляют к ним эритроциты барана, сенсибилизированные инсулином, и по усилению их взаимодействия при увеличении числа инсулиновых розеток в три и более раз определяют в крови наличие антител к инсулинорецепторам и диагностируют у больного сахарным диабетом инсу- линорезистентность иммунного генеза. Предлагаемый способ дает также возможность раннего выявления антирецепторных антител в крови больных диабетом, что позволяет диагностировать начало развития инсулинорезистентности.