Способ определения инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Ё

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике инсулинорезистентности и ее генеза у больных сахарным диабетом I типа. Цель изобретения - повышение точности диагностики. Ак- тивированные ин витро инсулином лимфоциты донора обрабатывают цельной сывороткой крови больного при температуре +37°с в течение 30 мин, добавляют к ним эритроциты барана, сенсибилизированные инсулином, при снижении числа розеткооб- разующих клеток в 2 и более раз диагностируют инсулинорезистентность иммунного генеза. Способ дает возможность чувствительной и объективной диагностики инсулинорезистентности и ее генеза, что важно в плане ее своевременной специфической профилактики и терапии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике инсулинорезистентности и ее генеза у больных сахарным диабетом I типа.

Наиболее часто встречается иммунный тип инсулинорезистентности - прототип (Потемкин В.В. Эндокринология, - М., 1986 г., с. 250). Одним из факторов ее генеза является образование антител к инсулино- рецепторам (Tan or S. Clin Res. - 1987, У.35, - 1 ISb 5. - P. 459-472).

Однако, методов выполнения этих антител, пригодных для клиники, в доступной нам медицинской литературе, мы не встретили.

Целью изобретения является повышение точности диагностики.

Способ осуществляют следующим образом.

В две центрифужные пробирки (одна - для определения исходного содержания инсулиновых розеток в активированной гормоном суспензии лейкоцитов крови донора; другая -для изучения действия на лейкоциты сыворотки крови больного) забирают по 0,1-0,2 мл крови донора в 0,1-0,2 мл 5% свежеприготовленног6 р ас твора цитрата натрия для предупреждения свертывания крови. После тщательного встряхивани я содержимого пробирок в него вносят для ли- зирования эритроцитов по 0,8-0,9 мл дистиллированной воды. Смесь встряхивают в течение 10-3,0 сек и добавляют до 10 мл питательную среду 199 Суспензии клеток центрифугируют в течение 5-6 мин при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, вновь добавляют 1 мл среды 299 и снова центрифугируют. Отсосав надосадочную жидкость, лимфоциты осадков активируют инсулином, для чего в пробирки вносят по 0,01 Ед бычьXI

О

VI

Јь

со со

его инсулина, содержащегося в 0,25 мл питательной среды. Осадок осторожно встряхивают и смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 30 мин. После инкубации смесь лейкоцитов в обеих пробирках отмывают от гормона с помощью 10 мл изотони- ческого раствора натрия хлорида центрифугированием при 1500 об/мин, в течение 5-6 мин. Затем осадок первой пробирки оставляюют временно без воздействия. Осадок второй пробирки соединяют с 0,1-0,2 мл исслеДУемойТполученной путем отстаива Ш кЈови дек мплементирован- ной .сыворотки крови больного, осторожно встряхивают и инкубируют при температуре +37°С в течение 30 мин.

После инкубации с сывороткой лейкоциты отмывают изотоническим раствором натрия хлорида (10 мл) путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 5-6 мин. Надосадочную жидкость отсасывают пипет- кой, после чего осадки в обеих пробирках ресуспендируют в 0,1-0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида рН -7,2. К полученным взвесям лейкоцитов добавляют по 0,1-0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитного диагностикума, и смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 10-15 мин, а затем в течение 18 ч в условиях холодильника. Через 18 ч в обе пробирки добавляют по 1 мл 50%-ного раствора бычьей сыворотки, центрифугируют смеси при 1500 об/мин 5- 6 мин, надосадочную жидкость сливают, а из осадков делают мазки, которые высушивают на воздухе, фиксируют в этиловом спирте 20-25 мин и окрашивают по Рома- новскому-Гимза. Просматривают под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмечая среди них число (в процентах) лимфоцитов, фиксировавших на себе три и более эритроцитов (розеткообра- зующие клетки - РОК). Суспензия лейкоцитов донора считается активированной гормоном, если в ней содержится от 20% и более розеткообразующих лимфоцитов, специфичных инсулину. При наличии в сы- воротке крови больного антител к инсули- норецепторам отмечается блокада ими инсулинорецепторов лимфоцитов крови донора с резким (в 2 - 10 раз и более) уменьшением числа РОК, взаимодействующих с гормоном, фиксированным на эритроцитах барана. На основании этих данных ставится диагноз инсулинорезистентности иммунного генеза.

Для приготовления диагностикума ис- пользуют эритроциты барана, обработанные гютаровым альдегидом. Свежие эритроциты барана трижды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида (рН- 7,2), центрифугируя взвесь в течение 5

минут при 1500 об/мин. Из отмытых эритроцитов готовят 5% взвесь, соединяя 055 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл забуференного изотонического раствора натрия хлорида рН-7,2. При глютаризации смешивают 5% взвесь эритроцитов с 0,25% свежеприготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1:1. Выдерживают смесь при температуре +37°С в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от глютарового альдегида забуференным изотоническим раствором натрия хлорида и доводят тем же раствором до первоначального объема (5% взвесь). Приготовленные таким образом эритроциты хранятся при температуре +14°С в течение 6 месяцев.

Для сенсибилизации эритроцитов инсулином глютаризированные эритроциты отмывают изотоническим раствором натрия хлорида рН-6,4 и доводят им же взвесь до первоначального объема. Затем соединяют с раствором инсулина, содержащим 20 ЕД в мл, в соотношении 1:1. Смесь оставляют при комнатной температуре на 20 мин, после чего отмывают дважды забуференным раствором натрия хлорида рН-7,2. Слив надосадочную жидкость, доводят обьем до первоначального (5% взвесь). В реакции используют 0,5% взвесь сенсибилизированных эритроцитов, которую готовят из исходной (5%) взвеси путем соединения 1 мл ее с 9 мл среды 199.

Пример 1. Больная П-ва Т,В, 1968 года рождения, Поступила в эндокринологическое отделение ОКБ г. Перми 28 октября 1988 года с жалобами на тошному, головную боль, периодически наступающее ощущение слабости. Больна с 1981 года, когда появились жажда, значительное похудание. В сентябре 1981 года после перенесенной ангины состояние резко ухудшилось и в тяжелом состоянии была госпитализирована в ОКБ, где был установлен диагноз сахарного диабета. С 1981 года периодически лечится с эндокринологическом отделении ОКБ. Объективно: рост 165 см, вес 64 кг. Кожные покровы гиперемированы, руброз щек, язык ярко-красный. Содержание сахара в крови - 10,8 - 8,19; 12,0; 16,1; 11,6:9,8; 12,2 м/моль/л. Содержание сахара в моче -5,6-2,8; 0,8; 1,2%. Больная получает 56 ЕД инсулина для инъекций.

Диагноз: сахарный диабет, 1 тип, средней тяжести, декомпенсированный, рецидивирующий. Кетоацидоз. Липодистрофия, печени. Инсулинорезистентность.

При исследовании крови больной в две центрифужные пробирки забрали 0,1 мл крови донора в 0,1 мл 5% свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После

тщательного встряхивания содержимого пробирок в нег лнесли по 0,8 мл дистиллированной воды. В смеси после встряхивания в течение 10 секунд добавили до 10 мл среду 199. Затем суспензии клеток отцентри- фугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин надосадочную жидкость отсосали пипеткой, добавили 1 мл среды 199 и снова отцен- трифугировали. Отсосав надосадочную жидкость, лимфоциты осадка проактивири- вали инсулином, для чего в пробирки внесли по 0,001 ЕД инсулина, содержащегося в 0,25 мл среды 199. Смесь инкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. После инкубации смесь лейкоцитов в обеих пробирках отмывали от гормона с помощью 10 мл изотонического раствора натрия хлорида центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Осадок одной пробирки соединили в 0,1 мл исследуемой сыворотки крови больного, встряхнули смесь и проинкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. Затем дейкоциты отмыли изотоническим раствором натрия хлорида (10 мл) путем центрифугирования и отсосали надосадочную жидкость. Далее осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида и к обеим взвесям добавили по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума, после чего проинкубировали их при температуре +37°С в течение 10 мин, а затем в течение 18 часов в условиях холодильника. Через 18 часов в обе пробирки добанили по 1 мл 50%-ного раствора бычьей сыворотки и процентрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость слили, а из осадков сделали мазки, которые высушили, зафиксирорвали этиловым спиртом в течение 20 мин и окрасили по Рома- новскому-Гимза, после чего просмотрели в мазках 100 лимфоцитов, отметив среди них число лимфоцитов, фиксировавших на себе три и более эритроцита.

При исследовании сыворотки крови больной заявляемым способом в ней обнаружены аутоантитела к инсулинорецепто- рам, так как сыворотка заблокирована инсулинорецепторы активированных лимфоцитов крови донора и уменьшила число инсулиновых розеток с 55% до 9%. Заключение: на основании данных проведенного анализа поставлен диагноз инсулино- резистентности иммунного генеза, обусловленной действием антирецепторных антител.

Пример 2, 0-ев А.А., 28 лет, поступил в эндокринологическое отделение ОКБ Г. Перми 27 сентября 1988 года с жалобами на общую слабость, жажду, жидкий стул. Болен

в течение 11 лет, в первые два года болезни перенес пять диабетических ком. В последние 4 года наблюдается частые гипогликемии. Объективно: больной пониженного

питания, вес 59 кг. Запах ацетона изо рта. Язык обложен. При пальпации отмечается болезненность в эпигастрии. Печень увеличена и выступает из-под подреберья на два поперечных пальца. Содержание сахара в

крови: 10,0-15,5-11,0-7,0-21,2 м/моль/л. Содержание сахара в моче: 3,6-3,8-3,6- 2,6%, ацетон +. Больной получает 54 ЕД инсулина для инъекций.

Диагноз: сахарный диабет Е типа, тяжелое течение. Кетоацидоз. Диабетическая энцефалопатия, Нефропатия II. Пиэлонефрит. Диабетический гепатит. Ретинспатия I. Ин- сулинорезистентность.

При исследовании крови больного в две

центрифужные пробирки забрали 0,1 мл крови донора в 0,1 мл 5% свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После тщательного встряхивания содержимого пробирки в него внесли по 0,8 мл дистиллированной воды. В смеси после встряхивания в течение 10 секунд добавили до 10 мл среду 199. Затем суспензии клеток отцент- рифугировали в течение 5 минут при 1500 об/мин, надосадочную жидкость

отсосали пипеткой, добавили 1 мл среды 199 и снова отцентрифугировали. Отсосав надосадочную жидкость, лимфоциты осадка проактивировали инсулином, для чего в пробирки внесли по 0,001 ЕД инсулина, содержащего в 0,25 мл среды 199. Смесь инкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. После инкубации смесь лейкоцитов в обеих пробирках отмыли от гормона с помощью 10 мл изотонического

раствора натрия хлорида центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Осадок одной пробирки соединили с 0,1 мл исследуемой сыворотки крови больного, встряхнули смесь и проинкубировали при

температуре +37°С в течение 30 мин. Затем лейкоциты отмыли изотоническим раствором натрия хлорида (10 мл) путем центрифугирования и отсосали надосадочную жидкость. Далее осадки в обеих пробирках

ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида и к обеим взвесям добавили по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного дизгностикума, после чего проинкубировали их при температуре +37°С в

течение 10 мин, а затем в течение 18 ч в условиях холодильника. Через 18 ч в обе пробирки добавили по 1 мл 30%-ного раствора бычьей сыворотки и процентрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин,

Надосадочную жидкость слили, а из осадков

сделали мазки, которые высушили, зафиксировали этиловым спиртом в течение 20 мин и окрасили по Роман овскому- Гимза, после чего просмотрели в мазках 100 лимфоцитов, отметив среди них число лимфоцитов, фиксировавших на себе три и более эритроцитов.

Пи исследовании сыворотки крови больного заявленным способом обнаружены аутоантитела к инсулинорецепторам, так как сыворотка заблокирована инсулиноре- цепторы активированных лимфоцитов донора и уменьшила число инсулиновых розеток в суспензии лейкоцитов донора с 55% до 5%.

Заключение: у больного диагносцирова- на инсулинорезистентность иммунного ге- неза, обусловленна . антирецепторными антителами.

П р и м е р 3: П-в И.М., 30 лет, практически здоров. Объективно: нормального телосложения, вес 64 кг. Язык чистый. Дыхание и сердечно-сосудистая система без особенностей. Живот мягкий, безболезненный. Содержание сахара в крови в пределах нормы. При исследовании сыворотки крови в две центрифужные пробирки забрали 0,1 мл крови донора в 0,1 мл 6% свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После тщательного встряхивания содержимого пробирок в него внесли по 0,6 мл дистиллированной воды. В смеси после встряхивания в течение 10 сек добавили до 10 мл среду 199. Затем суспензии клеток отцент- рифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость отсосали пипеткой, добавили 1 мл среды 199 и снова отцентрифугировали. Отсосав надосадочную жидкость лимфоциты осадка проакти- вировали инсулином, для чего в пробирки внесли по 0,001 ЕД инсулина, содержащегося в 0,25 мл среды 199. Смесь инкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. После инкубации смесь лейкоцитов в обеих пробирках отмыли от гормона с помощью 10 мл изотонического раствора натрия хлорида центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Осадок одной пробирки соединили с 0,1 мл исследуемой сыворотки крови, встряхнули смесь и проинкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. Затем лейкоциты отмыли изотоническим раствором натрия хлорида (10 мл) путем центрифугирования и отсосали надосадочную жидкость. Далее осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида и к обеим взвесям добавили по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума, после чего проинкубировали их при температуре +37°С в течение 10 мин, а затем в течение 18 ч в условиях холодильника. Через

18 ч в обе пробирки добавили по 1 мл 50%- ного раствора бычьей сыворотки и процент- рифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость слили, а из

5 осадков сделали мазки, которые высушили, зафиксировали этиловым спиртом в те- чение 20 мин и окрасили по РомановскомуТимза, после чего просмотрели в мазках 100 лимфоцитов, отметив сре0 ди них число димфоцитов фиксированных на себе три и более эритроцита.

В результате исследования установлено, что обработка лимфоцитов донора, стимулированных инсулином, сывороткой

5 крови здорового человека числа инсулиновых розеток не изменяет (41 % - до обработки и 43% после обработки клеток). Заключение: антител к инсулинорецепторам в крови здорового человека нет, инсули0 норезистентность исключается,

Для доказательства того, что мы имеет дело с антителами к инсулинорецепторам, а также для доказательства специфичности способа проводилась адсорбция антител к

5 инсулинорецепторам из сыворотки крови больного путем двойной обработки исследуемых сывороток крови больных активированными в условиях подкожным введением инсулина в дозе 0,25 КД/кг массы сплено0 цитами крысы. Цель активации - экспрессия на мембране спленоцитов крысы инсулино- рецепторов. После адсорбции спленоцита- ми, активированными инсулином, но не любым другим соединением (гистамином, се5 ротонином), сыворотки больных теряли способность блокировать образование розеток, специфичных инсулину. Так, если до адсорбции сыворотка крови больного Манылова уменьшала число инсулиновых

0 розеток в суспензии лейкоцитов крови донора с 38% до 12%, то после истощения сплено- цитами крысы она утратила эту способность, и число инсулиновых розеток в суспензии клеток крови донора после обработки их

5 адсорбированной сывороткой больного не отличалась от исходного (34%).

Преимущества предлагаемого способа заключаются в его высокой специфичности, точности, чувствительности, малом количе0 стве (0,1-0,2 мл) крови, забираемой как у донора, так и у больного, простоте технического исполнения способа и чтения его результатов, в необходимости минимальных количеств доступных реактивов и несложно5 го оборудования, что позволяет осуществлять проведение способа в условиях клиники (больницы), в отсутствии необходимости привлечения высококвалифицированных кадров для выполнения способа.

Выяснение генеза неэффективности инсулинотерапии, обусловленной разными иммунными фактор 5ми (антителами к инсулину, инсулинорецепторам и т.д.), представляет большой практический интерес, являясь основой для рациональной гормонотерапии, иммуносупрессивного и других видов лечения.

Способ дает возможность объективной диагностики инсулинорезистентности и ее генеза, что важно в плане ее своевременной специфической профилактики и терапии. Формула изобретения Способ определения инсулинорезистентности иммунного генеза у больных са

харным диабетом типа, включающий забор крови, выделение сыворотки с последующим ее исследованием, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности диагностики, сыворотку больного инкубируют с обработанными инсулином лимфоцитами донора при 37°С в течение 30 мин, далее добавляют сенсибилизированные инсулином эритроциты барана, подсчитывают количество розеткообразующих клеток и при снижении их количества по сравнению с количеством розеткообразующих клеток без сыворотки в два раза диагностируют инсулинорезистетность.